紅細胞輸注療效和鐵過載對再生障礙性貧血患者T淋巴細胞亞群的影響

朱琳超 孫菊琴 姚軼敏

再生障礙性貧血（aplastic anemia,AA）是一種由免疫介導的造血干細胞和造血微環境受損而導致骨髓造血衰竭的惡性血液病。AA的特點是骨髓造血干細胞增殖減少，導致外周血細胞減少，以貧血、出血和感染為主要臨床表現。輸血在AA患者的治療中發揮著重要作用，但長期輸血一方面會造成嚴重鐵過載，進而損傷組織，最終導致內臟器官功能障礙，其病程和預后與鐵過載程度有關[1-2]，另一方面可能造成輸血無效。有研究發現，β-地中海貧血患者由于長期輸血導致鐵過載，進一步損傷組織器官功能從而顯著影響疾病病程發展[3]。鐵是一種必需的元素，在生命過程中發揮著重要作用，如DNA合成、能量代謝和氧氣運輸，然而，過量的鐵會通過芬頓（Fenton）反應產生活性氧（reactive oxygen species,ROS）損傷細胞[4-6]。因此，維持鐵水平在正常范圍非常重要。近年來，鐵過載與免疫系統的關系受到越來越多的關注，免疫因子的失調增加了人體內鐵過載的風險[7-8]。淋巴細胞是免疫系統的重要細胞。研究發現，鐵過載可以通過增加ROS來調節T淋巴細胞的數量和功能[9]。另外，輸血無效在依賴輸血的血液病患者中非常常見，多數由免疫因素所導致[10]。筆者回顧了AA患者的臨床資料、血清鐵蛋白水平、T淋巴細胞亞群、輸注療效等參數，旨在探討不同輸注療效對鐵過載AA患者T淋巴細胞亞群的影響，以及T淋巴細胞與鐵過載程度的相關性，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2019年1月至2021年5月浙江中醫藥大學附屬第一醫院門診或住院AA患者158例。根據血常規、骨髓檢查和骨髓活檢確診，符合張之南《血液病診斷及療效標準》（第3版）中AA診斷標準[11]，所有患者均未行造血干細胞移植治療，臨床和實驗室檢查排除感染性疾病、免疫性疾病、骨髓移植和其他造血系統疾病。以鐵蛋白＞1 000 μg/L定義為鐵過載[12]。輸血患者均符合臨床輸血指征（Hb＜70 g/L），輸注的紅細胞均由浙江省血液中心提供，所有納入患者輸注去白細胞懸浮紅細胞后24 h內復查Hb。紅細胞輸注效果的判定：按輸注協作組提出的實行標準[13]，Hb 升高預期值（g/L）=[供者 Hb（g/L）×輸入量（L）/患者體重（kg）×0.085（L/kg）]×90%，其中輸入量以全血量為標準，紅細胞制劑折算為對應全血量；90%為檢驗誤差。Hb升高值未達到預期值的80%為輸注無效，Hb升高值達到或超過預期值的80%為輸注有效，根據輸注是否有效分為輸注有效組82例和輸注無效組76例。輸注有效組男 33 例，女 49 例，年齡 15～82（47.2±16.4）歲；其中鐵過載44例，非鐵過載38例。輸注無效組男28例，女 48 例，年齡 13～80（42.6±13.5）歲；其中鐵過載 41 例，非鐵過載35例。兩組患者性別、年齡及鐵過載患者比例的比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑與儀器 全自動血液分析儀為Beckman Coulter Gen.S LH780全自動血液分析儀及血常規配套試劑。流式細胞儀為Beckman Coulter FACSCantoⅡ五色流式細胞儀，單克隆抗體Cyto-STAT tetraCHROME CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-PE/CD8-ECD（批號：6607073，規格 0.5 ml），單色鼠抗人單克隆抗體CD25-FITC（批號：IM1026，規格：0.5 ml）均購自美國 Beckman Coulter公司，Abbott C1600全自動生化分析儀及配套試劑購自美國Abbott公司。

1.3 方法

1.3.1 血常規檢測 于清晨采集受檢者靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，采用Beckman Coulter Gen.S LH780全自動分析儀檢測血常規，于2 h內上機完成檢測。

1.3.2 T淋巴細胞亞群檢測 于清晨采集受檢者靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，標本在采集后6 h內染色、上機檢測。取流式管，加入10 μl不同熒光標記的單克隆抗體，加入外周血100 μl混勻，室溫下避光放置20 min，加入溶血素2 ml，室溫下放置20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 ml PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，500 μl PBS重懸細胞，采用流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群水平，包括 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD4＋CD25＋等 T 淋巴細胞。

1.3.3 血清鐵蛋白檢測 于清晨采集受檢者靜脈血4 ml于促凝管中，等血液凝固后3 500 r/min離心5 min后取血清，采用Abbott C1600全自動生化分析儀于6 h內完成檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；T淋巴細胞與鐵過載程度的相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同輸注療效患者T淋巴細胞亞群檢測結果的比較 兩組患者T淋巴細胞亞群比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 不同輸注療效患者T淋巴細胞亞群檢測結果的比較

2.2 輸注有效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細胞亞群檢測結果的比較 鐵過載者CD3＋T淋巴細胞比例低于非鐵過載者，差異有統計學意義（P＜0.05），其余T淋巴細胞亞群檢測結果比較差異均無統計學意義（均 P ＞0.05），見表2。

表2 輸注有效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細胞亞群檢測結果的比較

2.3 輸注無效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細胞亞群檢測結果比較 鐵過載者CD3＋T淋巴細胞比例低于非鐵過載者，差異有統計學意義（P＜0.05），其余T淋巴細胞亞群檢測結果比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表3。

表3 輸注無效組鐵過載與非鐵過載者T淋巴細胞亞群檢測結果比較

2.4 不同輸注療效患者CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白的相關性分析 全體AA患者CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白無相關性（r=0.095，P＞0.05），見圖1。紅細胞輸注有效患者，CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白呈負相關（r=-0.305，P＜0.05），見圖2。紅細胞輸注無效患者，CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白無相關性（r=0.024，P＞0.05），見圖3。

圖1 全體AA患者CD3+T淋巴細胞與鐵蛋白相關性的散點圖

圖2 輸注有效組患者CD3+T淋巴細胞與鐵蛋白相關性的散點圖

圖3 輸注無效組患者CD3+T淋巴細胞與鐵蛋白相關性的散點圖

3 討論

AA是血液系統常見疾病，治療依賴長期輸注，輸注一個單位紅細胞含有大約100 mg鐵，但鐵排泄的生理機制尚不清楚[14-15]。輸注的衰老紅細胞被巨噬細胞吞噬，不穩定的細胞鐵被釋放到血漿中并與轉鐵蛋白結合，當轉鐵蛋白結合飽和后，非轉鐵蛋白結合的鐵在不同器官積累導致鐵過載，引起一系列臨床并發癥[16-17]。雖然鐵過載對實質器官有明顯的影響，但鐵過載對造血系統的影響尚未闡明，其確切機制尚不清楚，越來越多的臨床證據表明，鐵過載對骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）和AA患者的造血功能有抑制作用，鐵螯合治療可以改善這一情況[18-19]。免疫異常是造成AA造血功能異常的主要原因，T淋巴細胞功能亢進，CD4+與CD8+T淋巴細胞亞群數量與比值改變，導致免疫功能發生改變，其免疫作用以造血細胞為靶細胞，最終造成全血細胞減少[20]。近年來，鐵過載與機體免疫的關系受到越來越多的關注，研究發現鐵過載可通過升高ROS損傷骨髓造血功能，包括直接對造血干細胞以及間接對造血支持間充質細胞的數量和功能損傷[21]。因此，一方面AA患者長期輸注導致鐵過載，鐵過載對造血又有抑制作用，另一方面長期輸注導致輸注無效，這已成為臨床一大難題。本研究分析免疫因素、輸注療效和鐵過載3者之間的關系，初步探討不同輸注療效對鐵過載AA患者T淋巴細胞亞群的影響。

本研究發現，輸注有效組與輸注無效組的T淋巴細胞亞群差異均無統計學意義（均P＞0.05），提示輸注療效對T淋巴細胞亞群影響不大，因此課題組進一步對紅細胞輸注療效進行分組，分別分析鐵過載對T淋巴細胞亞群的影響，輸注有效組與輸注無效組結果均顯示，鐵過載患者CD3+T淋巴細胞比例較非鐵過載均顯著降低。Guan等[20]研究MDS患者發現鐵過載組T淋巴細胞亞群紊亂，CD3+T淋巴細胞比例降低，同時淋巴細胞內ROS水平升高，這與本研究結果一致。鐵過載促發氧化應激反應，增加的ROS通過多條信號通路，如p38 MAPK/p53和p21 WAF1/Cip1/Sdi1通路，對T淋巴細胞起調節作用，影響免疫功能，導致細胞凋亡[22]。AA患者由于鐵過載導致ROS產生增加，促進T細胞衰老和凋亡增加，從而顯著降低T細胞比例。基于以上結果，筆者進一步將試驗對象分為3組，即AA患者、輸注有效的AA患者和輸注無效的AA患者，分別分析CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白的相關性，發現輸注有效組CD3＋T淋巴細胞與鐵蛋白呈負相關，其他兩組與鐵蛋白無相關性，提示鐵過載對輸注有效的AA患者CD3＋T淋巴細胞影響較大。

綜上所述，輸注有效的AA患者鐵過載對CD3＋T淋巴細胞影響較大，兩者呈負相關，內在免疫因素會影響輸注療效，但輸注療效對鐵過載和T淋巴細胞的相互作用起何作用的報道較少。筆者將進一步研究鐵過載與T淋巴細胞相互作用的機制，以及輸注療效影響鐵過載與T淋巴細胞關系的內在機制，為臨床治療AA患者鐵過載導致的免疫功能紊亂以及減少輸注無效提供理論依據。