肺泡灌洗液二代測序在學齡兒童大葉性肺炎病原學診斷中的應用

何 敏，楊景龍，史瑞明，黃燕萍

(西安交通大學第一附屬醫院兒科，陜西 西安 710061)

大葉性肺炎是兒童下呼吸道感染性疾病中較常見的一種，臨床起病急，病情重，病程長，易發生肺外并發癥，近幾年來發病呈逐漸增多的趨勢[1]。肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌是其感染的主要病原。傳統的病原學診斷方法，例如咽拭子、痰培養、血清病原抗體檢測、血培養等，尚不能滿足臨床快速、精準治療的需求。宏基因二代測序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)可及時、準確地進行病原學檢測，對指導臨床診斷、治療具有重要作用[2]。本研究應用電子纖維支氣管鏡對一組大葉性肺炎患兒行支氣管肺泡灌洗，檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的病原情況，并對病原學和臨床特征進行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2020年2月在西安交通大學第一附屬醫院住院治療的24例學齡期大葉性肺炎患兒為研究對象，按照是否采用肺泡灌洗液二代基因測序檢測病原分為研究組和對照組各12例。納入標準：①大葉性肺炎患兒的診斷標準參考諸福棠《實用兒科學》及兒童社區獲得性肺炎診療規范[3-4]，患兒具有發熱、咳嗽等表現，經聽診、胸片或CT、血常規檢查確診為大葉性肺炎；②本研究獲得患兒家長的知情同意、我院醫學倫理委員會的批準。排除標準：①伴有凝血功能疾病、貧血；②伴有腫瘤疾病；③支氣管畸形；④氣管異物；⑤長期應用免疫抑制劑、糖皮質激素的患兒；⑥因各種原因無法接受支氣管肺泡灌洗。

1.2 研究方法

研究組采用傳統方法及肺泡灌洗液二代基因測序檢測病原，對照組只采用傳統方法檢測病原。具體為兩組行支氣管鏡后采集肺泡灌洗液送檢一般細菌培養，結核桿菌、真菌、細菌涂片，研究組在此基礎上送檢肺泡灌洗液mNGS。

支氣管肺泡灌洗方法：參考國內兒科纖維支氣管鏡指南[5]，術前6 h禁食，選用Olympus BF260電子支氣管鏡，予以靜脈鎮靜加局部麻醉的方法，采用2%利多卡因咽喉部局麻，纖維支氣管鏡經鼻、咽喉、聲門進入氣道，觀察支氣管形態，37℃生理鹽水灌洗至炎癥嚴重的肺段，1.0mL/kg至少灌洗3次，隨即負壓吸引以獲取BALF，標本置一次性無菌硅化收集器中，緩慢拔出纖維支氣管鏡。操作過程中予以吸氧，常規監測血氧飽和度、血壓和心率等，密切觀察患兒呼吸、唇色、面色等情況。

研究組肺泡灌洗液mNGS檢測方法：BALF外送至深圳華大基因股份有限公司，提取核酸后行PMseq病原微生物DNA高通量測序，測序所得的病原序列與病原庫進行對比得到最終結果。報告致病菌的標準參考已有文獻[6]。

此外，收集兩組熱程(發病至入院前)、影像學檢查中肺炎病變部位等臨床資料；收集兩組紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、凝血功能、肺炎支原體抗體及病毒抗體檢測等指標。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組一般資料及臨床特征比較

兩組患兒年齡、性別、肺炎范圍比較，差異無統計學意義(P>0.05)；研究組熱程較長，累及肺葉較多，差異有統計學意義(χ2/t值分別為5.716、6.972，P<0.05)，見表1。

表1 研究組與對照組一般資料及臨床特征比較Table 1 Comparison of general data and clinical features of the children between the two

2.2 血清病原學檢測

24例標本中血清肺炎支原體抗體(mycoplasma pneumonia，Mp)21例(87.5%)陽性，嗜肺軍團菌抗體陽性5例(20.8%)，流感B型抗體陽性2例(8.3%)，合胞病毒抗體陽性1例(4.2%)，研究組與對照組的病原檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 研究組與對照組血清病原抗體檢出率[n(%)]Table 2 Comparison of detection rates of pathogen antibodies in serum of the children between the two groups [n(%)]

2.3 肺泡灌洗液涂片及培養

24例患兒BALF細菌、結核、真菌涂片均陰性；對照組菌培養均陰性，研究組菌培養陽性2例(16.7%)，其中1例BALF培養為肺炎鏈球菌，1例痰培養及BALF培養均為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSR)。

2.4 肺泡灌洗液mNGS

2.4.1 病原學分析

研究組肺泡灌洗液mNGS分析顯示，5例單一肺炎支原體拷貝數陽性，其拷貝數為19 101～139 304，其余均為混合性感染，具體為EB病毒+肺炎支原體2例(16.7%)，格雷文尼放線菌+肺炎支原體2例(16.7%)，金黃色葡萄球菌+流感嗜血桿菌1例(8.3%)，微小微單胞菌+侵肺戴李斯特菌1例(8.3%)，細環病毒16型+肺炎支原體1例(8.3%)；1例金黃色葡萄球菌拷貝數519，肺泡灌洗液培養為MRSR；另有1例，肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體陽性但肺泡灌洗液培養為肺炎鏈球菌，見表3。

2.4.2 肺炎支原體檢出結果

研究組中1例患兒血清嗜肺軍團菌IgM陽性，肺炎支原體抗體陰性而肺泡灌洗液mNGS顯示肺炎支原體序列數陽性(37 769)；2例入院時肺炎支原體IgM、IgG定量正常(參考值分別為IgM<1.1，IgG<3.6)，同期肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體序列數分別為120 363、20 276，治療1周后復查肺炎支原體IgM、IgG定量均升高，IgM分別為3.6、5.1，IgG分別為145、320，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 研究組檢出病原類型Table 3 Pathogen types detected in the study group

2.4.3 病原序列數與臨床指標的相關性分析

10例肺炎支原體感染患兒的序列數與CRP、ESR、住院時長有強正相關性(r值分別為0.891、0.861、0.814，P<0.05)，其中序列數最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，故在一定程度上表明肺炎支原體載量越大，肺部病變越重，住院時間越長。

表4 10例肺泡灌洗液肺炎支原體序列數與臨床指標的相關性分析Table 4 Correlations of sequence number of Mycoplasma pneumoniae in BALF with serological indexes and hospital stay in 10 children

3 討論

3.1 微生物二代測序指導兒童肺炎病原學精準診治

肺炎是兒童期常見的感染性疾病，在全球5歲以下導致兒童死亡的疾病中仍排第1位[7]。早期和快速精準判斷病原微生物，針對性使用抗生素治療，對于有效預防控制、臨床診治及改善預后具有十分重要的作用。傳統微生物培養技術陽性率低，培養周期較長，而抗原/抗體的免疫學方法、病原體特異核酸序列PCR方法等，僅針對于已知病原，無法檢測未知的病原。本研究病原血清學抗體檢測僅提示肺炎支原體、嗜肺軍團菌、流感病毒、合胞病毒感染，肺泡灌洗液病原學涂片均陰性，菌培養僅2例陽性，靈敏度較低。在熱程及累及肺炎范圍方面，研究組與對照組存在差異，原因可能與患兒發熱時間越長、累及肺葉范圍越廣、病情越重，患兒家屬對mNGS的接受程度越高，此外也與家庭經濟狀況、文化程度等社會因素有關，因此存在一定選擇偏倚。

微生物宏基因二代測序技術具有準確性高、通量高的特點，無需微生物培養，直接提取標本核算測序，可檢測樣本中所有微生物信息，24～36 h即可判斷病原，在敏感性及準確性方面與傳統的病原檢測技術差異均具有統計學意義，在臨床醫療中發揮重要的作用[8-9]。有學者使用肺泡灌洗液二代基因測序34例兒童重癥肺炎，檢出病原32例，陽性率高達94.1%[10]。另有學者通過二代測序檢測76例重癥肺炎肺泡灌洗液，其靈敏度達86.84%，顯著高于細菌培養、免疫熒光、定量PCR等傳統檢測技術[11]。Takeuchi等[12]研究也表明mNGS可用于呼吸道感染患者BALF中病原體的分子診斷和監測。柯創宏等[13]通過高通量測序檢測43例嬰幼兒重癥或疑難細菌性肺炎的病原體靈敏度較高，并檢測出經普通培養難以獲得的鮑特菌，與本研究結果一致。

3.2 二代測序病原序列數與預后相關

近年來Mp感染發生率呈逐漸增高的趨勢，本研究12例大葉性肺炎患兒mNGS檢測BALF中也發現Mp為主要病原。自2012年全球多地區發生Mp暴發流行，日本、英國的感染病例也顯著升高[14]。Mp是兒童社區獲得性肺炎(communityacquired pneumonia，CAP)的重要病原體，可占CAP的10%～30%，Mp流行時可增加3～5倍[15]。由于Mp對大環內酯類藥物耐藥等一系列復雜的機制使得難治性肺炎支原體肺炎的發病率增高，常引起肺不張、肺壞死、支氣管擴張及閉塞性細支氣管炎等不良預后和后遺癥，因此，早診斷、早治療是Mp感染診治的關鍵。本研究2例入院時肺炎支原體抗體IgM、IgG均正常，而肺泡灌洗液Mp序列數均升高，治療1周后復測肺炎支原體IgM、IgG陽性，表明mNGS可以更早的發現Mp。另外，10例支原體肺炎患兒的Mp序列數與CRP、ESR、住院時長有強相關性，其中序列數最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，肺部實變范圍廣，臨床癥狀重，住院時間明顯延長。

3.3 病原微生物二代測序的局限性

眾多研究證明mNGS能夠快速、準確地檢測和鑒定病原體[16-17]，但是仍然存在一些局限性。首先，由于病變的位置和患者的耐受性，通過支氣管鏡檢查獲得的標本可能不含有價值的病原體DNA，繼而會導致結果假陰性。在以后的研究中應開發標準化程序以進一步提高mNGS的檢測產出率。其次，由于真菌和細菌的細胞壁較厚，在DNA提取過程中采用了破壁處理，這可能會影響RNA病毒的檢測。因此，如果懷疑RNA病毒感染，應采用RNA提取和逆轉錄程序。此外，mNGS無法區分定植和致病菌株，檢測結果需結合患兒臨床特征、實驗室檢查、影像學結果綜合分析。最后，經濟成本也是限制二代測序技術推廣的重要因素。mNGS的平均成本為每份標本3 000元左右，與傳統的病原體檢測相比經濟負擔較大，相信隨著科技的發展，未來二代測序檢測病原體的成本將很快逼近甚至低于血培養等傳統檢測技術，推動其臨床應用。

綜上，mNGS可提高兒童大葉性肺炎的病原診斷準確率，對臨床治療有指導作用。但本研究是單中心回顧性研究，仍需要更多前瞻性和多中心數據進一步驗證mNGS分析的準確性，實現精準診療。