沉默環磷腺苷效應元件結合蛋白1對乳腺癌細胞生物學行為的影響

辛肇晨，吳 茜，BANG SOYEON，王 紅，楊子昂，張宏偉

復旦大學附屬中山醫院普通外科，上海 200032

乳腺癌是全球發病率最高的腫瘤之一，占女性新發癌癥總數的24.5%［1］。乳腺癌的發生發展與激素、肥胖、遺傳等多種因素有關。環磷腺苷效應元件結合蛋白1（cAMP-response element binding protein 1, CREB1）是亮氨酸拉鏈轉錄因子CREB/ATF家族的一員，可被多種蛋白激酶磷酸化，進而調控靶基因的轉錄過程［2-3］。CREB1與肺癌［4］、腎癌［5］和膠質瘤［6］的發生發展有關，但CREB1對乳腺癌細胞生物學行為的影響鮮見報道。

本研究通過構建CREB1表達沉默的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231，采用Western印跡、CCK-8實驗、集落形成實驗、流式細胞術、細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移和侵襲實驗觀察CREB1對乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的診療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑和儀器 人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和人腎上皮細胞系HEK293T購于美國模式菌種收集中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）、DMEM培養基、胰蛋白酶購 于 美 國Gibco公 司（16140063、11995065、15090046）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于美國Hyclone公司（SH30256.01B）。攜帶短發夾RNA（shRNA）序列的pLKO.1載體購自美國Sigma公司。Lipo3000試劑購于美國Invitrogen公司（L3000015）；NP-40裂解液、細胞周期與細胞凋亡流式檢測試劑盒購于海門碧云天生物技術研究 所（P0013F、C1052）；BCA蛋 白 定 量 試 劑盒 購 于 美 國Thermo公 司（23227）。CREB1、GAPDH、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6一 抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購于 美 國CST公 司（9197、5174、55506、18048、12790、13331、7074）；CCK-8試劑盒、Caspase 3、 Bcl-2、Survivin、Bax一 抗 購 于 英 國Abcam公司（ab228554、ab32351、ab32124、ab76424、ab32503）。ECL Western印跡試劑盒購于南京諾唯贊醫療科技有限公司（E412-01）；Transwell小室和BD Matrigel基質膠購自北京明陽科華生物科技有限公司（353097、354480）。酶標儀和流式細胞儀購自上海伯樂生命醫學產品有限公司。

1.2 細胞培養及分組 MCF-7和MDA-MB-231細胞系用含10%FBS和100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養基在37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。將細胞分為shSCR組（空載質粒）、shCREB1#1組和shCREB1#2組。

1.3 載體構建及慢病毒轉染 用Lipo3000將shRNA-pLKO.1質粒轉染至HEK293T細胞，用慢病毒感染HEK293T細胞后，收集病毒液，轉染MCF-7和MDA-MB-231細胞。用嘌呤霉素篩選7 d后，獲得穩定沉默CREB1的乳腺癌細胞系。shRNA的序列見表1。

表1 shRNA序列

1.4 Western印跡和RT-PCR驗證轉染效率 Western印跡：使用NP-40裂解液提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后，將蛋白轉至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育，4℃搖床過夜；第2天回收，經TBST洗膜后，于室溫下用二抗孵育 1 h，用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。

RT-PCR：CREB1及GAPDH的PCR引 物 如表2所示。配置20 μL反應體系，設定兩步法RTPCR程序，每個組設置3個副孔；讀取樣本光密度（D）值。

表2 RT-PCR引物序列

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期的細胞制成單細胞懸液，以100 mL/孔接種于96孔板中，使每孔含細胞3000～5000。每個細胞系設置夠5 d測量的副孔，將96孔板置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養，分別于培養1、2、3、4、5 d后棄去3個副孔中的培養基，加入10 μL CCK-8溶液，于培養箱中孵育2 h后，測定450 nm處的D值。

1.6 集落形成實驗 取對數生長期的細胞制成單細胞懸液，用細胞板對細胞進行計數。將計數好的細胞以600個/孔接種于6孔板并使細胞分散均勻，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2周。待孔板中形成肉眼可見的克隆時，棄上清液，用PBS清洗，陰干，甲醇固定。加適量結晶紫染色20 min，統計細胞的克隆數。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期 將細胞以2×105個/孔接種至6孔板，于培養箱中培養過夜。取對數生長期的細胞，消化并收集，4℃下200×g離心5 min，收集細胞懸液。用70%冷乙醇固定細胞18 h，用PBS洗滌2次。每個試管加入500 μL PI/RNase染液，混勻，室溫下避光孵育20 min后置于冰上，并于1 h內通過流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 鋪板、制備單細胞懸液過程同上。用冰PBS洗滌細胞2次后，將細胞轉移到流式管中，離心，棄上清。加入300 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer懸浮細胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻，避光，室溫孵育15 min。 上機前5 min加入5 μL的PI染色，并補加200 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer。根據Annexin Ⅴ和PI的染色情況篩選出凋亡細胞。

1.9 Western印跡檢測細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白 采用Western印跡檢測CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Bcl-2、Survivin、Caspase 3、Bax蛋白的表達情況，以GAPDH為內參。實驗步驟同上。

1.10 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用馬克筆在六孔板背后劃線，每隔1 cm劃一道，每孔至少有5條線穿過。每孔鋪約5×105個細胞，每組設置3個副孔，培養過夜。用移液槍頭在六孔板內按照馬克筆標記垂直劃線，用PBS洗滌細胞后，加入無血清培養基。將六孔板放入培養箱中培養，于 8 h、24 h后拍照并計算劃痕閉合率。

1.11 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 進行遷移實驗前，先用無血清培養基饑餓細胞12 h，制備單細胞懸液。在Transwell小室上層加入300 μL無血清培養基，在培養箱中孵育2 h。在上層小室中加入100 μL細胞懸液，在下層小室中加入600 μL 含10%FBS的培養基，每組設置3個復孔。將Transwell小室放入培養箱培養16 h后取出，用5%戊二醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下觀察、拍照，并對細胞進行計數。侵襲實驗除須在接種細胞前將BD Matrigel基質膠置于上層小室并培養24 h外，余步驟同遷移實驗。

1.12 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism繪制統計圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結果

2.1 CREB1表達沉默細胞株的鑒定 結果 （圖1）顯 示，shRNA干 擾 后，shCREB1#1組 和shCREB1#2組中MCF-7和MDA-MB-231細胞系CREB1的mRNA和蛋白水平均低于shSCR組（P＜ 0.001），提示CREB1沉默細胞株構建成功。

圖1 RT-PCR和Western印跡檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞系中CREB1的表達A、C：MCF-7細胞系；B、D：MDA-MB-231細胞系。n＝3, ±s；***P＜0.001。

2.2 沉默CREB1對乳腺癌細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果（圖2A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖能力均明顯減弱（P＜ 0.001）。集落形成實驗結果（圖2B、2C）顯示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 的克隆數減少（P＜0.001）。

圖2 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖和集落形成的影響A：CCK-8法檢測細胞增殖能力；B、C：集落形成實驗檢測細胞的克隆數。n＝3, ±s； ***P＜0.001。

2.3 沉默CREB1對乳腺癌細胞周期的影響 流式細胞分析結果（圖3A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的G1期細胞占比增多，而S期細胞占比減少（P＜0.05）。同時，Western印跡結果（圖3B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7細胞中CDK2、CDK4和CDK6的表達量降低，MDA-MB-231細 胞 中CDK2、CDK4、CDK6和Cyclin D1的表達量降低。

圖3 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞細胞周期的影響A：流式細胞術檢測各組細胞G1期、S期、G2期細胞占比；B：Western印跡檢測細胞周期相關蛋白的表達水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 沉默CREB1對乳腺癌細胞凋亡的影響 流式細胞分析結果（圖4A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的凋亡率升高（P＜ 0.05）。Western印跡結果（圖4B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 的 促 凋 亡蛋白Caspase3、Bax的表達水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達水平降低（P＜0.05），其中以shCREB1#2組的凋亡相關蛋白表達變化更明顯。

圖4 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡的影響A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：Western印跡檢測細胞凋亡相關蛋白的表達水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。

2.5 CREB1沉默對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

2.5.1 細胞劃痕實驗 結果（圖5）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 劃 痕8 h和24 h后的愈合率降低（P＜0.05）。

圖5 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞遷移能力的影響n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5.2 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 結果（圖6）顯 示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDAMB-231細胞的遷移和侵襲數量均減少（P＜0.05）。

圖6 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響A、B：Transwell遷移實驗；C、D：Transwell侵襲實驗。Original magnification:×200。n＝3, x± s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3 討論

CREB1于1987年首先由Montrminy等從大鼠腦組織中分離純化出來［7-8］。近年來，CREB1在腫瘤發生發展中的作用越來越受到關注。CREB1作為重要的轉錄因子，可以與多種靶基因的啟動子結合，從而調控基因的表達，包括CDK4、Cyclin D1和Cyclin A等細胞周期關鍵蛋白［9］。在膠質瘤中，CREB1可通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路促進Cyclin D1、Bcl-2的表達，而促進膠質瘤細胞的增殖并抑制凋亡［10-11］。過表達CREB1可抵抗miR-133a-3p對視網膜母細胞瘤的促凋亡作用［12］。

本研究中，沉默CREB1可導致乳腺癌細胞的增殖能力減弱，G1/S期阻滯以及CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1表達水平下降，提示CREB1可能在乳腺癌細胞的增殖過程中起關鍵作用。而且，沉默CREB1還引起乳腺癌細胞的凋亡增加，凋亡蛋白Caspase 3、Bax的表達水平升高而促生存因子Bcl-2、Survivin的表達水平降低，表明CREB1可能參與乳腺癌細胞凋亡信號的調控。盡管本研究Western印跡結果中MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達的變化與MDA-MB-231細胞并不完全一致，但與沉默CREB1抑制乳腺癌細胞周期和促進其凋亡的結論一致。關于CREB1調控乳腺癌增殖和凋亡過程的分子機制尚待進一步研究。

腫瘤細胞遷移是一個復雜的、多因素調控的過程。該過程除受外部因素影響外，還與腫瘤細胞基因表達有關［13-15］。細胞遷移和侵襲的發生與細胞間黏附減少和細胞外基質降解密切相關。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-CAD）在上皮細胞胞間連接中起重要作用，當E-CAD缺乏時，上皮細胞會具有間充質細胞的特性，其流動性大幅增強［16］。 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族是與腫瘤轉移密切相關，可以降解多種細胞外基質中的蛋白質，促進腫瘤細胞轉移［17］。本研究細胞劃痕實驗和Transwell實驗發現，沉默CREB1可導致乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力減弱，表明CREB1與乳腺癌細胞的轉移有關。但本研究未進一步測定E-CAD和MMPs等蛋白的表達水平，后續可通過Western印跡、RT-PCR、ELISA等方法測定相關蛋白的表達水平，并對遷移和侵襲的相關信號通路進行探索。

目前有關CREB1與乳腺癌關系的研究多側重于CREB1作為中介因子對其他腫瘤相關蛋白的調節作用［18-19］，而CREB1調控的下游靶基因眾多，這些靶基因對乳腺癌生物學行為的影響仍需進行研究。本研究通過沉默CREB1基因，抑制了CREB1調節相關基因轉錄的“總閘門”作用，證明CREB1表達的降低可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導細胞凋亡，為乳腺癌的治療提供了新的靶點。未來可補充體內實驗，在動物模型中對細胞實驗結果進行進一步驗證。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。