長鏈非編碼RNA DBH-AS1通過下調AKT1表達抑制胰腺癌進展

李慧芬，程文英，陶元平，楊 樂，歐陽柳，李小玲，汪珍光，曹晶珠

1. 海軍軍醫大學第三附屬醫院肝外三科，上海 200433 2. 中國人民解放軍92493部隊醫院內三科，葫蘆島 125003 3. 海軍軍醫大學第一附屬醫院普外三科，上海 200433 4. 海軍軍醫大學第一附屬醫院內分泌科，上海 200433

中國人群中胰腺癌發病率正逐年上升，2019年新發病例約占全世界總病例數的20%［1-2］。目前，手術切除和化療是胰腺癌的主要治療策略［3］。在過去的幾十年中，胰腺癌患者的總體生存時間未得到明顯改善，患者5年生存率仍低于5%［4-5］。因此，深入了解胰腺癌發生與進展的詳細分子機制至關重要。

近年來，越來越多的研究證明，長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是細胞正常生理和病理過程中的重要調控因子［6］。多種lncRNAs已被證實在多種腫瘤組織中異常表達，進而促進或抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力［7-9］。本研究旨在檢測lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中的表達情況，探討DBH-AS1在胰腺癌進展中潛在的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究樣本 選擇2015年7月至2017年12月海軍軍醫大學第一附屬醫院普外三科收治的原發胰腺癌患者45例，收集患者經手術切除的胰腺癌組織和對應癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣至少大于2 cm）。所有樣本離體后于液氮保存，以備后續實驗。所有組織樣本均經病理證實為胰腺癌。本研究經海軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準（2017-148-06），所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要材料及試劑 本研究所用細胞均購自中科院上海細胞庫。LncRNA DBH-AS1干擾慢病毒和空白（陰性）對照均購自上海吉瑪基因。CCK-8試劑盒購自上海碧云天。Transwell小室購自美國Corning公司。AKT1、p-mTOR、mTOR以及β-actin抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞培養和病毒轉染 正常永生化人胰腺上皮細胞株（HPDE6C7）和4株人胰腺癌細胞株（CFPAC-1、Mia-capa2、L3.6pl和PANC1）均用添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。依照病毒試劑轉染說明，構建敲低DBH-AS1的胰腺癌細胞株。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） TRIzol法提取組織和細胞的總RNA，用Nanodrop 2000測定RNA濃度并反轉錄為cDNA。采用ViiATM 7實時qRT-PCR系統（美國Applied Biosystems公司）進行qRT-PCR，反應體系為10 μL，包括2×SYBR Premix ExTaqTM試 劑5 μL、ROX校 正 染 料Ⅱ 0.2 μL、上游和下游引物各0.4 μL、cDNA模板 2 μL、雙蒸水2 μL。以GAPDH基因為內參基因，應用2－ΔΔCT法計算DBH-AS1和AKT1基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 細胞增殖 將細胞接種于96孔板，加入CCK-8溶液采用酶標儀分別在0 h、24 h、48 h和72 h測定450 nm波長的光密度值。

1.6 克隆形成 將各組處理細胞消化計數并分別接種在6孔板中，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養10 d，出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，隨后結晶紫染色，采用Image J軟件進行克隆計數。

1.7 侵襲和遷移 將細胞密度調整至1.5×104個/mL，取100 μL細胞懸液加入鋪有稀釋的基質膠的transwell小室的上室，將加有10%FBS的DMEM培養基加入下室，孵育24 h，底部細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色后，顯微鏡下隨機選擇5個視野計數。細胞遷移實驗在上室中不添加基質膠，其余同前。

1.8 Western印跡 用RIPA緩沖液進行細胞和組織裂解提取蛋白質，提取過程保持低溫，用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，用5×loading buffer和PBS調整蛋白濃度并加熱變性。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，在4℃條件下一抗孵育過夜（AKT1、p-mTOR、mTOR以 及Actin），洗 膜 后室溫下二抗孵育2 h，洗滌，顯影。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析及作圖。符合正態分布的計量資料均以±s表示，所有實驗均至少完成3次以上生物學重復實驗。2組組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線比較DBH-AS1表達量與胰腺癌患者預后的關系。采用Pearson相關分析檢測兩變量之間的相關性。檢驗水準（α）為0.05。

2 結果

2.1 DBH-AS1在胰腺癌組織中的表達情況 在線數據庫GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http://gepia.cancer-pku.cn/）結果顯示（圖1A），lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織的表達明顯低于癌旁組織，差異倍數＞2（P＜0.05）。應用qRT-PCR檢測lncRNA DBH-AS1在45例胰腺癌患者腫瘤組織和對應癌旁組織中的表達情況，結果（圖1B）顯示：DBH-AS1在胰腺癌組織中的表達水平低于對應的癌旁組織（0.0372±0.0032vs0.0792±0.0070），差異倍數＞2（P＜0.01）。結果（圖1C）顯示：與正常胰腺細胞系（HPDE6C7）相比，DBH-AS1在胰腺癌細胞系（Mia-capa2、CFPAC-1、L3.6pl和PANC1）中的表達水平也下調，差異倍數＞2（P＜0.001）。

圖1 DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌細胞系中表達下調A：GEPIA數據庫中胰腺癌組織和正常胰腺組織中DBH-AS1的表達水平；B：qRT-PCR分析胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌旁組織中DBH-AS1的表達水平（n＝451）；C：qRT-PCR分析正常胰腺細胞系（HPDE6C7）和胰腺癌細胞（CFPAC-1、Mia-capa2、L3.6pl和PANC1）中DBH-AS1的表達水平。每組3個重復孔，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.2 DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達水平與患者惡性臨床特征的相關性 根據lncRNA DBH-AS1在胰腺癌患者腫瘤組織中的中位表達量（0.0380），將45例患者分為DBH-AS1低表達組 （n＝23）和DBH-AS1高表達組（n＝22）。結果（表2）顯示，DBH-AS1在胰腺癌組織中的低表達與腫瘤分化（P＝0.038）、TNM分期（P＝0.029）和淋巴結轉移（P＝0.006）相關。

表2 lncRNA DBH-AS1表達水平與胰腺癌患者臨床特征的關系n(%)

2.3 DBH-AS1在胰腺癌患者腫瘤組織中表達水平與患者預后的相關性 以DBH-AS1在胰腺癌組織中表達水平的中位數為分界線，將176例胰腺癌患者分為DBH-AS1高表達組（n＝88）和DBH-AS1低表達組（n＝88）。結果（圖2）顯示，與胰腺癌腫瘤組織DBH-AS1高表達組患者相比，DBH-AS1低表達組患者的無瘤生存率（P＝0.013）和總體生存率（P＝0.009）較低，差異有統計學意義。

圖2 數據庫中DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中表達下調與患者預后較差相關

2.4 敲低DBH-AS1對胰腺癌細胞增殖能力和克隆形成能力的影響 構建敲低DBH-AS1慢病毒，轉染至DBH-AS1表達相對較高的2株胰腺癌細胞系（Mia-capa2和PANC1）中。結果（圖3A）顯示，轉染敲低DBH-AS1慢病毒后，Mia-capa2細胞中DBH-AS1的表達水平比對照組下降約6倍 （P＜0.001），PANC1細 胞 中DBH-AS1的 表 達水平較對照組下降約8倍（P＜0.001）。CCK-8檢測結果（圖3B、3C）顯示，與對照組相比，轉染敲低DBH-AS1慢病毒后，Mia-capa2和PANC1細胞的增殖能力分別在48 h和72 h后提高（P＜ 0.05）。細胞克隆形成實驗結果（圖3D～3E）顯示，干擾DBH-AS1表達后Mia-capa2和PANC1細胞的克隆形成能力較對照組顯著增強（Mia-capa2：207±11.55vs86.0±2.309，P＜0.001；PANC1：228.7±14.53vs84.0±2.887，P＜0.001）。

圖3 敲低DBH-AS1表達可增強胰腺癌細胞增殖和克隆形成能力A：qRT-PCR檢測慢病毒轉染前后DBH-AS1的表達水平；B,C：CCK-8法檢測轉染si-NC或si-DBH-AS1后PANC1 （B）和Mia-capa2 （C）細胞增殖情況；D：集落形成法檢測轉染si-NC或si-DBH-AS1對Mia-capa2和PANC1細胞克隆形成能力的影響。每組3個重復孔，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.5 遷移和侵襲 Transwell實驗結果（圖4A）顯 示，干 擾DBH-AS1表 達 后，Mia-capa2和PANC1細胞的遷移能力較對照組增強（Miacapa2：222.7±2.603vs131.3±3.528，P＜0.001；PANC1：113.7±0.882vs88.3±0.333，P＜0.001）。侵襲實驗結果（圖4B）顯示，Mia-capa2和PANC1細胞的侵襲能力較對照組顯著增強（Mia-capa2：241.7±2.333vs111.3±1.202，P＜0.01；PANC1： 73.3±1.333vs60.0±1.732，P＜0.001）。

圖4 敲低DBH-AS1表達可增強胰腺癌細胞遷移（A）和侵襲能力（B）Original magnification:×100; 每組3個重復孔，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.6 DBH-AS1調 控AKT1/mTOR信 號 通 路 在 線 數 據 庫GEPIA結果（圖5A）顯 示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達水平與AKT1 mRNA的表達水平負相關（r＝－0.18，P＝ 0.016）。qRT-PCR結果（圖5B）顯 示，干 擾DBH-AS1表 達 后，Mia-capa2細 胞 和PANC1細胞的AKT1 mRNA表達水平較對照組顯著提高（Mia-capa2：4.057±0.180vs1.000±0.505，P＜0.001；PANC1：5.425±0.896vs1.000±0.706，P＜0.001）。Western印跡結果（圖5C、5D）表明，干擾DBH-AS1表達后Mia-capa2和PANC1細胞的AKT1蛋白（Mia-capa2：2.541±0.182vs1.000±0.121，P＜0.001；PANC1：2.392±0.252vs1.000±0.243，P＜0.001）和p-mTOR/mTOR蛋白（Mia-capa2：2.023±0.102vs1.000±0.289；PANC1：2.171±0.153vs1.000±0.228，P＜0.001）表達水平較對照組顯著提高。

圖5 LncRNA DBH-AS1通過調控AKT1表達抑制mTOR信號通路A：利用在線數據庫GEPIA數據分析lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達水平與AKT1 mRNA的表達水平的相關性；B：qRT-PCR檢測轉染si-NC或si-DBH-AS1后Mia-capa2和PANC1細胞中AKT1 mRNA的表達水平；C,D：Western 印跡檢測轉染si-NC或si-DBH-AS1后，Mia-capa2和PANC1細胞AKT1/mTOR通路分子的蛋白表達水平。***P＜0.001。

3 討論

目前，已有大量lncRNAs被證實參與胰腺癌的發生與進展。例如，胰腺導管腺癌中lncRNA PANDAR表達異常上調，并且與胰腺癌腫瘤血管侵犯密切相關［10］。另有研究［11］發現，lncRNA LOXL1-AS1在胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌細胞系中表達上調，且LOXL1-AS1通過吸附miR-28-5p上調SEMA7A表達，促進胰腺癌進展。

此外，最新研究［12］表明，lncRNA XLOC通過與c-Myc結合并增強其蛋白穩定性，從而促進胰腺癌的發生和谷氨酸代謝。LncRNA DBH-AS1從染色體9q34轉錄而來，既往研究發現DBH-AS1在多種惡性腫瘤組織中表達上調并發揮重要的癌基因作用，例如肝癌［13］、非小細胞肺癌［14］、骨肉瘤［15］及彌 漫 大B細胞淋巴瘤［16］等。但是，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌發病中的作用機制仍然尚未完全清楚。

本研究結合在線數據庫GEPIA以及qRT-PCR結果發現，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中表達下調，同時qRT-PCR結果也表明DBH-AS1在胰腺癌細胞系中均表達下調。利用隊列樣本發現，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中的低表達與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關，而生存分析結果提示胰腺癌腫瘤組織中DBH-AS1低表達的患者預后較差。通過慢病毒轉染，進一步研究敲低DBH-AS1對胰腺癌細胞功能的影響，結果顯示，敲低DBH-AS1可顯著促進胰腺癌細胞的增殖、克隆形成和遷移侵襲能力。上述結果提示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中具有抑癌作用。

為了進一步探究相關機制，首先利用在線GEPIA數據庫分析，發現DBH-AS1與AKT1在胰腺癌腫瘤組織中的表達負相關，提示在胰腺癌中DBH-AS1可能下調AKT1表達；進一步通過qRTPCR和Western印跡實驗，驗證了敲低DBH-AS1的表達可上調AKT1 mRNA和蛋白水平，同時，敲低DBH-AS1表達可上調mTOR蛋白表達。以上結果提示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中可抑制AKT1/mTOR信號通路。

本研究存在一定的局限性：（1）DBH-AS1的表達與胰腺癌患者的預后以及病理特征之間的關系需要進一步擴大樣本量研究，以進一步證實DBH-AS1在胰腺癌中作為預后標志物的潛力；（2）本研究僅探究了敲低DBH-AS1對胰腺癌細胞惡性表型的影響，而缺乏對過表達DBH-AS1后胰腺癌細胞惡性表型變化的研究；（3）需要進一步通過補充體內試驗，驗證DBH-AS1對胰腺癌細胞增殖和轉移能力的影響；（4）DBH-AS1調控AKT1表達的作用機制有待進一步研究，其是否通過作為內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）來調控AKT1有待進一步驗證。

綜上所述，本研究發現DBH-AS1在胰腺癌組織中表達下調與患者不良預后相關，敲低DBH-AS1可顯著促進胰腺癌細胞增殖、克隆形成和遷移侵襲能力。機制研究結果提示，DBH-AS1/AKT1/mTOR軸可能是胰腺癌進展的關鍵信號通路。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。