熊果酸衍生物的合成及抗腫瘤活性的研究

丁明雪，孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

Survivin是凋亡蛋白(IAPs)抑制劑家族的成員之一，據(jù)報道在幾乎所有已知的癌癥中都高度表達，但在正常組織中不存在，并且在細胞分裂和抑制細胞凋亡中起著關(guān)鍵作用.在過去的幾十年中，Survivin蛋白已成為癌癥研究和治療領(lǐng)域中一個具有吸引力的蛋白質(zhì)分子.目前，僅開發(fā)了幾種Survivin抑制劑，其中大多數(shù)通過與其他生物分子相互作用抑制survivin的表達，而不是直接與survivin結(jié)合[1-4].

五環(huán)三萜類化合物是一種廣泛存在于自然界的化合物，包括熊果酸(UA)、積雪草酸(AA)、齊墩果酸(OA)等.天然產(chǎn)物UA是從多種中草藥中分離出來的.它的衍生物具有很多種藥理活性，如保肝、抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性.許多證據(jù)表明，熊果酸衍生物在腫瘤發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著重要的作用，在體內(nèi)和體外抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并在體內(nèi)和體外誘導腫瘤細胞分化和凋亡.本文采用化學修飾的方法，對熊果酸衍生物進行了廣泛的研究，以增強其抗腫瘤作用并提高其生物利用度[5-10].

以往研究表明，在C-3和/或C-28位點，經(jīng)官能團、羥基乙酰化或酰胺/酯修飾的UA衍生物具有良好的生物活性[11-15].本文設(shè)計合成了5種UA衍生物，并在體外評估它們對三種癌細胞系(HeLa、SKOV3和BGC-823)的細胞毒活性.

一系列新的UA化合物的合成路線見圖1.以熊果酸為先導化合物,由Jones試劑在丙酮中氧化得到化合物UA-1.然后，通過鹽酸羥胺將UA-1的羰基轉(zhuǎn)化為肟基，得到化合物UA-2.化合物UA-2的酯化得到相應的酯衍生物2a～2e.化合物2a～2e與氯乙酰氯在K2CO3存在下在丙酮中反應得到化合物Ⅰ1～5.

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of target compounds

1 實驗部分

1.1 3-氧代-熊果烷型-12-烯-28-羧酸的制備(UA-1)

在0 ℃下向UA(50 mg，0.11 mmol)的丙酮(5 mL)溶液中滴定新配制的Jone′s試劑(0.2 mL)，并將反應混合物在室溫下攪拌1 h.然后向其中加入異丙醇(2 mL),將混合物在室溫下攪拌30 min以淬滅其抗氧化性.將混合物倒入飽和鹽水中，并用乙酸乙酯(20 mL×3)萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥并濃縮，得到白色固體粉末UA-1，產(chǎn)率73.8%,mp 195.0～197.4 ℃.ESI-MS(m/z):456.4[M+H]+.

1.2 3-肟基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸的制備(UA-2)

向UA-1(50 mg，0.11 mmol)的無水吡啶溶液中加入鹽酸羥胺(100 mg，1.44 mmol)，將混合物在115 ℃回流1.5 h，倒入冰水中，產(chǎn)生大量白色沉淀物.過濾，并將濾餅用水洗滌，干燥，得到白色固體UA-2，產(chǎn)率為82.96%,mp 215.6～218.1 ℃.ESI-MS(m/z)：470.2[M+H]+.

1.3 3-肟基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸甲酯的制備(2a)

向UA-2(100 mg，0.20 mmol)的DMF(5 mL)溶液中加入無水碳酸鉀(30 mg)，在室溫下加入5滴碘甲烷，反應結(jié)束后，將混合物用飽和鹽水(2 ml)和乙酸乙酯(10 mL×3)進行萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗制白色固體.最后通過柱色譜法[V(PE)/V(EA)=6/1]純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物2a，產(chǎn)率為70.3%,mp 241.6～242.1 ℃.ESI-MS(m/z)：484.8[M+H]+.

1.4 3-肟基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸乙酯的制備(2b)

與化合物2a的制備方法相同，由UA-2(100 mg，0.20 mmol)、K2CO3(30.0 mg，0.22 mmol)和5滴溴乙烷的DMF溶液制備化合物2b.通過柱色譜法[V(PE)/V(EA)=6/1]純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物2b，產(chǎn)率為63.5%,mp 256.1～257.9 ℃.ESI-MS(m/z)：498.9[M+H]+.

1.5 3-肟基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸異丙酯的制備(2c)

與化合物2a的制備方法相同，由UA-2(100 mg，0.20 mmol)、K2CO3(30.0 mg，0.22 mmol)和5滴異丙基溴在DMF中制備化合物2c. 通過柱色譜法[V(PE)/V(EA)=6/1]純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物2c，產(chǎn)率為73.8%,mp 261.6～263.5 ℃.ESI-MS(m/z)：512.6[M+H]+.

1.6 3-肟基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸乙氧基羰基甲酸酯的制備(2d)

與化合物2a的制備方法相同，由UA-2(100 mg，0.22 mmol)、K2CO3(30.0 mg，0.22 mmol)和3滴溴乙酸酯在DMF中制備化合物2d.通過柱色譜法[V(PE)/V(EA)=6/1]純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物2d，產(chǎn)率為70.5%,mp 245.2～247.5 ℃.ESI-MS(m/z)：556.3[M+H]+.

1.7 3-肟基-熊果烷型-12-烯-羧酸芐酯的制備(2e)

與化合物2a的制備方法相同，由UA-2(100 mg，0.22 mmol)、K2CO3(30.0 mg，0.22 mmol)和3滴溴芐在DMF中制備化合物2e.通過柱色譜法[V(PE)/V(EA)=6/1]純化粗產(chǎn)物，得到白色固體化合物2d，收率為65.4%,mp 223.8～225.1 ℃.ESI-MS(m/z):560.3[M+H]+.

1.8 3-[氯-乙酰氧基]亞氨基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸甲酯的制備(Ⅰ1)

向2a的丙酮(10 mL)溶液中添加無水碳酸鉀(30 mg)，并在冰浴位置緩慢滴加7滴氯乙酰氯，并將混合物在56 ℃回流2 h，然后將其倒入飽和水中. 用鹽水(10 ml)洗滌，并用乙酸乙酯(10 mL×3)萃取，有機層用無水Na2SO4干燥并濃縮，得到粗制白色固體.然后將粗產(chǎn)物通過柱色譜法純化[V(PE)/V(EA)=6/1]，得到白色固體化合物Ⅰ1，產(chǎn)率為40.5%,mp 115.5～118.3 ℃.

按照與化合物Ⅰ1相同的方法，將2a依次替換為2b、2c、2d、2e，得到白色固體化合物Ⅰ2～Ⅰ5.目標化合物的數(shù)據(jù)分析見表1.

表1 目標化合物的數(shù)據(jù)分析Table 1 Data analysis of target compounds

續(xù)表

2 結(jié)果與討論

以吉非替尼和VP-16為陽性對照物，選擇3種人類癌細胞系(HeLa、SKOV3和BGC-823)為靶細胞，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT比色法)測定目標化合物及其母體化合物UA的抗癌潛力和細胞毒活性.實驗方法參見文獻[16].活性數(shù)據(jù)見表2.

表2 目標化合物對HeLa、SKOV3 和 BGC-823細胞系的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of target compounds on HeLa,SKOV3 and BGC-823 cell lines

從表2可以看出：所測目標化合物對Hela、BGC-823和SKOV3細胞的生長均具有一定的抑制作用，目標化合物IC50值Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3?Ⅰ5>Ⅰ4，表明UA-28位連接具有支鏈的鹵代烷較直鏈鹵代烷有更好的活性；同時，隨著酯鏈的延長，其抗腫瘤活性也有所增加.綜上所述,化合物Ⅰ4值得進一步研究.

3 結(jié) 論

以UA為起始原料,通過在UA-28位羧基成酯,設(shè)計并合成了5個新的UA衍生物,目標化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR確證.采用MTT法考察目標化合物的體外抗腫瘤活性,結(jié)果表明:目標化合物對Hela和SKOV3細胞的生長均具有一定的抑制作用，且優(yōu)于母體熊果酸，說明其抗腫瘤活性顯著增強.研究結(jié)果對進一步優(yōu)化熊果酸衍生物的設(shè)計、增強其抗腫瘤活性研究具有參考價值.