青稞精釀啤酒釀造工藝優化

陳祖乙，安明哲，李 麗，王祥余，宗緒巖

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 643002；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 643002；3.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 643002；4.廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f），屬禾本科小麥族大麥屬一年生草本植物，主要分布于我國青藏高原、川西高原等高海拔地區，因其內外穎殼分離，籽粒裸露也稱為裸大麥[1]，具有高蛋白、高膳食纖維、高維生素和低脂肪、低糖的組分特性，并且富含β-葡聚糖、酚類化合物和γ-氨基丁酸等生物活性成分[2]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗衰老、抗癌、增強免疫力等功效[3]。有研究指出我國種植的青稞β-葡聚糖含量為3.66～8.62g/100g青稞，普遍高于歐美等國家和地區培植的大麥中β-葡聚糖含量[4]；青稞富含天然多酚類物質，總酚含量為（132.15～912.51）mg/100 g干質量，總黃酮含量為（32～58）mg/100 g干質量，高于玉米、大米、小麥和燕麥等常見谷物[5]；高原藏青稞γ-氨基丁酸的平均含量為19mg/100g，高于其他地區的大麥和青稞品種[6]。

人們求新求異、營養保健的需求促進了品種繁多的特色精釀啤酒創新[7]，如水果啤酒、渾濁啤酒、無醇啤酒和功能性啤酒等，通過不同原料選擇搭配賦予啤酒獨特的口味和營養[8]。其中特殊輔料啤酒是精釀啤酒中最受歡迎的品類之一，因具有特色輔料的風味和豐富的營養特性而深受消費者喜愛。有研究表明在啤酒釀造中添加紅薯[9]、薏米[10]、藜麥[11]、黑米[12]等輔料可以提高成品啤酒的生物活性物質含量并賦予啤酒獨特口感。

由于青稞營養豐富，富含生物活性成分，將其添加到啤酒釀造中，釀造出一款既具有特殊口感又可以保留青稞特殊營養價值的“特色輔料啤酒”，不僅可以拓展青稞的應用范圍，也擴大了消費者對于啤酒品種的選擇。周韶華等[13]以大麥麥芽、小麥麥芽和青稞麥芽為原料，通過上面發酵酵母No.303主發酵和下面發酵酵母No.308后發酵而成的青稞啤酒，符合優質淡色啤酒國家標準且具有怡人的特征香氣；朱光煒等[14]使用上面發酵酵母和大麥麥芽、青稞麥芽和大米，生產出殺口力強，泡沫潔白細膩，掛杯持久的青稞啤酒，通過添加硅膠、硅藻土、抗氧化劑初步解決了生產過程中出現的過濾困難等問題；薛文華等[15]以青稞麥芽為主要原料制備青稞鮮啤，通過單因素和正交試驗優化其釀造工藝，結果表明，適宜的發酵條件為：青稞發芽天數4 d，啤酒花添加量0.06%，麥芽汁濃度為10 °P，所制成的青稞鮮啤酒精度為3.2%vol，色度為5.0，酒體清澈透亮、泡沫細膩、香氣明顯；張榮霞等[16]使用大麥麥芽、青稞麥芽和青稞紅曲為原料制得青稞紅曲啤酒，其γ-氨基丁酸質量濃度為91.3 mg/L，高于市售啤酒中γ-氨基丁酸質量濃度（40～65）mg/L。而關于響應面法優化青稞精釀啤酒釀造參數以及其生物活性成分的分析，國內外研究相對較少。

本研究以大麥芽、青稞為原料，探討了啤酒花添加量、初始麥汁濃度和主發酵溫度對青稞精釀啤酒酒精度和感官評分的影響，在此基礎上通過響應面法（response surface methodology，RSM）對青稞精釀啤酒釀造工藝進行優化，并對青稞精釀啤酒的基本指標和生物活性成分指標進行分析，為青稞精釀啤酒的產業化開發提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

青稞（藏青8號）：甘孜藏族自治州農業科學研究所；澳洲大麥芽（EBC3.3-5.0）、薩茲啤酒花：華東釀酒設備輔料有限公司；LALLEMAND鉆石拉格酵母（Saccharomyces pastorianus）：實驗室保存。

1.1.2 試劑

高效液化酶（20 U/g）：百斯杰生物技術有限公司；γ-氨基丁酸標準品（純度＞98%）、蘆丁標準品（純度＞98%）：酷爾化學科技有限公司；β-葡聚糖標準品（純度＞98%）：南京都萊生技術有限公司；苯酚、硼酸、次氯酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、鄰苯二胺、鹽酸、剛果紅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

0～32%手持折光儀：邦西儀器科技（上海）有限公司；TUV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；AHC-600B智能人工氣候箱：上海容威儀器有限公司；WGZ-200濁度儀：上海儀電物光有限公司；BHS-6數顯恒溫水浴鍋：寧波市群安實驗儀器有限公司；KQ-50B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；TCS-60電子臺秤：永康市華鷹衡器有限公司；304不銹鋼對輥粉碎機：廈門新天工貿有限公司；10 L、20 L不銹鋼鍋：浙江邦豐實業有限公司；WS-38不銹鋼電熱開水器：廣東偉納斯不銹鋼實業有限公司；30 L不銹鋼小型錐形發酵罐、48 L精釀啤酒糖化一體機：合眾精釀啤酒設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 青稞精釀啤酒的加工工藝流程及操作要點

青稞糊化醪的制備：青稞磨碎成粉（占總原料30%）加入純凈自來水與20 U/g高效液化酶，料水比1∶5（g∶mL），分步糊化。第一步：于45 ℃恒溫保持10 min；第二步：于70 ℃恒溫保持40 min；第三步：于90 ℃恒溫保持10 min；然后煮沸10 min。

麥芽粉碎：稱取一定量的大麥芽，將對輥粉碎機間隙調至0.2 mm進行研磨。研磨前需用大麥芽質量5%的水拌勻大麥芽，使粉碎的時候達到心碎皮不碎的效果，在糖化過程中不僅可以使麥芽中的營養物質充分析出到麥汁中，還能減少麥皮中有害物質溶解。保留較為完整的麥殼可以為麥汁過濾階段提供天然的濾層。

糖化：參照管敦儀[17]的雙醪浸出糖化法：大麥芽粉碎（占總原料70%）與純凈自來水混合，料水比1.0∶4.5（g∶mL），分步糖化，升溫過程中應保持攪拌（第一步酶浸出：于35 ℃恒溫保持15 min；第二步蛋白質休止：于50 ℃恒溫水解50 min；第三步糖化：與青稞糊化醪兌醪后于65 ℃恒溫保持60 min；第四步滅酶活：于78 ℃恒溫保持10 min，終止糖化）。

麥汁過濾：所得的麥汁攪拌均勻后靜置20 min，使麥糟沉降形成糟層，進行三次回流的操作使過濾得到的麥汁比較清亮，露出糟層后使用78 ℃的熱水分兩次進行洗糟，將麥汁糖度調節至設定的初始麥汁濃度值。且整個過濾與洗糟的過程麥汁流速度不能過快，避免破壞糟層影響過濾效果，直至過濾完成。

麥汁煮沸：將過濾得到的麥汁進行煮沸操作。根據麥汁體積計算需要的啤酒花總量（2.5 g/L），在麥汁微微沸騰時開始計時，同時立即加入占總量50%的薩茲啤酒花，在煮沸結束前10 min 加上剩余50%的薩茲啤酒花。整個煮沸時間為60 min，控制10%左右的煮沸強度。

麥汁冷卻：利用滅菌處理過的盤管換熱器將麥汁冷卻到20 ℃左右后，用虹吸管迅速將清澈麥汁導入滅菌后的帶泄壓閥2 L玻璃三角瓶，并將三角瓶置于氣候箱中使溫度降至12 ℃。

干酵母的活化：以1 g/L（酵母質量/麥汁體積）的比例稱取干酵母，在100 mL的燒杯中加入5倍于干酵母質量的20 ℃無菌水，然后添加干酵母至無菌水中，混勻后于20 ℃氣候箱靜置20 min。

發酵：將活化好的酵母液添加到冷麥汁中，封罐進行主發酵（12 ℃發酵14 d左右），當麥汁糖度降至5°P時分離發酵液，添加質量濃度為2.2 g/L的蔗糖混勻裝入450 mL棕色啤酒瓶定后發酵14 d，至酒體中無明顯雙乙酰氣味時（餿味），發酵成熟，后酵結束即得青稞精釀啤酒成品。

冷藏：后發酵完成，將啤酒儲存溫度降溫到4 ℃冷藏3 d，以保持啤酒非生物穩定性，即得青稞精釀啤酒成品。

1.3.2 青稞精釀啤酒的釀造工藝優化

（1）單因素試驗

分別考察啤酒花添加量（0.5 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L和4.5 g/L）、初始麥汁濃度（8°P、10°P、12°P、14°P和16°P）、主發酵溫度（8 ℃、10 ℃、12 ℃、14 ℃和16 ℃）對青稞精釀啤酒酒精度和感官評分的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取啤酒花添加量（A）、初始麥汁濃度（B）、主發酵溫度（C）為考察因子，以感官評分（Y）為響應值，利用響應面軟件Design-Expert V8.0.6進行響應面優化試驗設計，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 青稞精釀啤酒的釀造工藝參數優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing process parameters optimization of highland barley craft beer

1.3.3 青稞精釀啤酒分析檢測

（1）基本理化性質

樣品預處理：將樣品在超聲10 min（振蕩頻率調節至在30 kHz）除氣并過濾，4 ℃儲存備用。

酒精度、原麥汁濃度、浸出物濃度、真正發酵度、泡持性、濁度、總酸含量、苦味值、色度、雙乙酰的測定：按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的方法進行測定。

（2）生物活性成分

青稞精釀啤酒β-葡聚糖的測定采用剛果紅法[18]，γ-氨基丁酸的測定采用Berthelot比色法[19]，總黃酮的測定采用蘆丁比色法[20]。

1.3.4 感官評價

邀請20位經培訓的釀酒工程專業同學和老師，分別對青稞精釀啤酒外觀、泡沫、香氣以及口感進行評分[21]，總分100分，具體評分標準見表2。

表2 青稞精釀啤酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of highland barley craft beer

續表

1.3.5 數據統計與分析

采用Origin 2019軟件和Excel2019軟件對試驗數據進行整理作圖和統計學分析，采用Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計和分析，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 啤酒花添加量的確定

啤酒花有助于啤酒呈現獨特的感官特性[22]。啤酒花添加量是影響啤酒口感風味的重要因素，它不僅可以平衡麥芽的甜味、提供特殊的口感與香氣，還可以澄清麥芽汁和抑制革蘭氏陽性菌生長，使啤酒具有一定的保質期[23]。啤酒花添加量對青稞精釀啤酒品質的影響見圖1。

圖1 啤酒花添加量對青稞精釀啤酒品質的影響Fig.1 Effect of hop addition on the quality of highland barley craft beer

由圖1可知，青稞精釀啤酒隨啤酒花添加量在0.5～4.5 g/L范圍內的增加，酒精度變化趨勢不明顯。隨著啤酒花添加量在0.5～2.5 g/L范圍內的增加，感官評分逐漸增加；當啤酒花添加量為2.5 g/L時，感官評分最高，為86.4分；繼續增加啤酒花添加量時，感官評分下降。當啤酒花添加量較低時，體現不出青稞精釀啤酒的風味，口感較甘甜、豐富感低、缺乏酒體；啤酒花添加量較高時，青稞精釀啤酒不爽口，苦味值增大，并且覆蓋麥芽的香氣，使啤酒口感不佳。因此，選擇啤酒花添加量1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L進行響應面試驗。

2.1.2 初始麥汁濃度的確定

初始麥汁濃度與酵母細胞活力及發酵性能有關，其幾乎決定了酵母生長可以利用物質的多少和成品啤酒的各項理化指標[24]。初始麥汁濃度對青稞精釀啤酒品質的影響見圖2。由圖2可知，隨著初始麥汁濃度在8～16°P范圍內的增大，青稞精釀啤酒的酒精度呈逐漸增加的趨勢。其原因可能是，隨著初始麥汁濃度的增加，酵母的可發酵糖含量也增加，產生的乙醇含量也增加。隨著初始麥汁濃度在8～14°P范圍內的增加，感官評分呈逐漸增加的趨勢；當麥汁濃度為14°P時，感官評分最高，為86分；當初始麥汁濃度繼續增加，感官評分逐漸下降。其原因可能是初始麥汁濃度較低時，麥汁中酵母可利用的可發酵糖、氨基酸等營養物質含量較少，發酵力弱，導致酒體輕薄，產生的風味物質少，青稞精釀啤酒寡淡無味，感官品評分數較低；當初始麥汁濃度較高時，酵母的可發酵糖含量增加，產生的乙醇含量也增加，但由于麥汁的黏度和滲透壓較大，影響了酵母的代謝過程，并且啤酒中剩余糖分過多導致啤酒的渾濁度變高，甜味掩蓋了酒花帶來的清苦口感，導致酒精味和麥香削弱了酒花香氣[25]。因此，選擇初始麥汁濃度12°P、14°P和16°P進行響應面試驗。

圖2 初始麥汁濃度對青稞精釀啤酒品質的影響Fig.2 Effect of initial wort concentration on the quality of highland barley craft beer

2.1.3 主發酵溫度的確定

發酵溫度是影響啤酒口感和香氣的重要因素，同時影響乙醇和啤酒產量[26]。主發酵溫度對青稞精釀啤酒品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著主發酵溫度在8～12 ℃范圍內的升高，酒精度呈逐漸增加的趨勢；當發酵溫度為12 ℃時，酒精度達到最高值，為5.29%vol；繼續增加主發酵溫度，青稞精釀啤酒的酒精度有所下降。其原因可能是，發酵溫度的提高有利于提高啤酒酵母發酵能力，使得啤酒中乙醇含量增加；但溫度過多會影響酵母的繁殖代謝速度，導致酵母衰老過快，縮短發酵周期，降低酵母的產酒能力[27]。隨著主發酵溫度在8～12 ℃的增加時，感官評分逐漸增加；當主發酵溫度為12 ℃時，感官評分最高，為83.9分；繼續增加主發酵溫度，感官評分下降。其原因可能是，在較低的溫度環境下，酵母呼吸作用不強。在較高溫度的環境下，酵母的增殖速度提高，呼吸作用增強，青稞精釀啤酒的感官品質下降。因此，選擇主發酵溫度10 ℃、12 ℃和14 ℃進行響應面試驗。

圖3 主發酵溫度對青稞精釀啤酒品質的影響Fig.3 Effect of main fermentation temperature on the quality of highland barley craft beer

2.2 青稞精釀啤酒釀造工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

響應面試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 青稞精釀啤酒釀造工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for brewing process optimization of highland barley craft beer

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design Expert8.0.6軟件對表3的試驗數據進行多元回歸擬合，得到感官評分對啤酒花添加量（A）、初始麥汁濃度（B）、主發酵溫度（C）的擬合方程：

由表4可知，所建立的感官評分回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.140 7＞0.05）。回歸模型的決定系數R2=0.982 0，調整決定系數R2Adj=0.958 8，說明模型能夠較好地反映響應值的變化，回歸模型和預測值之間有較好擬合度試驗結果具有一定可靠性。由P值可知，回歸模型的一次項A及二次項A2、B2、C2對感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；一次項B對結果影響顯著（P＜0.05）；其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個因素對感官評分的影響大小次序為啤酒花添加量＞初始麥汁濃度＞主發酵溫度。

2.2.2 響應因子交互作用分析

各因素的交互作用對感官評分影響的響應面和等高線見圖4。從圖4可知，固定主發酵溫度（C），感官得分隨著啤酒花添加量（A）與初始麥汁濃度（B）的增加呈先緩慢增加后下降的趨勢，啤酒花添加量（A）與初始麥汁濃度（B）相互作用較明顯。啤酒花添加量和初始麥汁濃度的交互作用（AB）大于啤酒花添加量和主發酵溫度交互作用（AC），初始麥汁濃度和主發酵溫度的交互作用（BC）最小。

圖4 各因素的交互作用對感官評分影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory scores

2.2.3 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到青稞精釀啤酒最佳釀造條件為：啤酒花添加量2.1 g/L、初始麥汁濃度14.2°P、主發酵溫度12.2 ℃，在此條件下進行釀造，青稞精釀啤酒的感官評分預測值為87.5分。考慮到實際操作的可能性，將青稞精釀啤酒釀造工藝調整為：啤酒花添加量2 g/L、初始麥汁濃度14°P、主發酵溫度12 ℃，采用20 L的發酵罐進行3次平行驗證試驗，得到的青稞精釀啤酒口味純正、爽口、酒體協調，具有青稞麥香的特征，感官評分實際值為86.7分，實際值與預測值近似。說明青稞精釀啤酒釀造工藝條件具有實際可行性。

2.3 青稞精釀啤酒的品質分析

2.3.1 理化指標結果

在青稞精釀啤酒最佳釀造條件下釀造青稞精釀啤酒，對其基本指標進行檢測，結果見表5。由表5可知，啤酒色度為16.58，屬于GB/T 4927—2008《啤酒》中濃色啤酒的范圍。其中青稞精釀啤酒的總酸、酒精度和泡持性指標均達到濃色啤酒優級標準，說明添加30%青稞作為輔料釀造青稞精釀啤酒的工藝是可行的。雙乙酰是啤酒異味的主要來源，為主發酵過程中酵母代謝產物，在后發酵期會逐步被還原，使其濃度下降，此啤酒的雙乙酰含量在國標允許的正常范圍內。

表5 青稞精釀啤酒基本指標檢測結果Table 5 Detection results of basic indexes of highland barley craft beer

2.3.2 青稞精釀啤酒生物活性化合物分析

對實驗室釀造的全大麥啤酒（100%大麥芽）、普通啤酒（70%大麥芽+30%大米）和青稞精釀啤酒（70%大麥芽+30%青稞）的β-葡聚糖、γ-氨基丁酸、總黃酮的含量進行對比，結果見表6。由表6可知，添加青稞釀造的青稞精釀啤酒中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和總黃酮含量較高。開發富含生物活性成分的青稞精釀啤酒既能夠豐富啤酒市場，也能豐富特色谷物啤酒種類，是一種較好的攝入β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和黃酮的飲品。

表6 青稞精釀啤酒的生物活性物質含量測定結果Table 6 Determination results of bioactive substances contents of highland barley craft beer

3 結論

本研究以感官評分為響應值，通過單因素試驗和響應面試驗優化得到青稞精釀啤酒的最優釀造工藝條件為：啤酒花添加量2 g/L，初始麥汁濃度14°P，主發酵溫度12 ℃。在此優化工藝條件下，青稞精釀啤酒的感官評分為86.7分，酒精度為5.28%vol，顏色純正、酒體豐滿、香氣典型，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和總黃酮的含量較高，分別為（124.26±9.74）mg/L、（81.79±6.37）mg/L、（138.65±2.07）mg/L。本研究為青稞精釀啤酒的生產提供了理論和實踐基礎，對青稞的有效利用有重要的指導意義。青稞精釀啤酒的整體風味是多種物質或工藝條件共同作用的結果，本研究僅對青稞精釀的釀造工藝進行了優化，青稞精釀啤酒的抗氧化能力與風味物質還有待研究。