超聲波對脫色葵花籽蛋白色澤和功能特性的影響

秦那日蘇, 李泓頡, 李雪馨, 包小蘭

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

葵花籽是世界四大油料作物(大豆、油菜、向日葵和花生)之一，也是我國重要的油料作物。目前葵花籽主要用于提取油脂，其提取油脂之后的副產物即為葵花籽粕，葵花籽粕富含蛋白質和膳食纖維，其中蛋白質質量分數高達29%～43%[1]；葵花籽蛋白的氨基酸組成較均衡，抗營養成分和有毒物質較少，適宜人體攝取。此外，葵花籽蛋白還具有良好的消化率(90%)和生物價(60)[2，3]，是一種優質的植物蛋白資源。但由于葵花籽粕中含有的多酚類物質在蛋白提取過程中，在堿性條件下易氧化而發生褐變，導致提取出的蛋白呈墨綠色或深灰色，其色澤很難被大眾所接受[4，5]，同時天然的葵花籽蛋白因其自身或加工條件的原因，其功能特性較差，導致大量的葵花籽粕并未被深度開發利用，只能用于動物飼料或者直接丟棄，造成了極大的資源浪費。因此，從葵花籽粕中脫除多酚類物質提取淺色葵花籽蛋白的同時也要提高蛋白的功能特性，使其更廣泛的應用于食品工業中是目前急需解決的一個問題。

大孔吸附樹脂是一種有機高聚物吸附劑，具有比表面積大、選擇性好、再生簡便和穩定性高等優點[6]，是近年來廣泛應用于植物蛋白的一種重要的脫色方法。Pickardt等[7]在弱酸條件下通過XAD-16大孔樹脂來提取淺色的葵花籽粕蛋白，發現大孔樹脂吸附脫色后其蛋白L*值顯著提高，顏色明顯改善。超聲波因具有操作方便、安全性好和營養價值破壞小等優點[8]，因此被廣泛應用于動植物蛋白的改性上。目前，國內外利用超聲波技術對蛋白質改性進行了大量研究。Zhu等[9]研究了超聲處理對核桃分離蛋白功能特性和結構的影響，發現超聲處理后其溶解性、乳化性和乳化穩定性均顯著增加，且蛋白質二級結構和三級結構都發生了改變。但是，利用超聲波技術對脫色的葵花籽蛋白功能特性的影響的研究鮮有報道。

本研究以低溫脫脂葵花籽粕為原料，首先采用大孔樹脂吸附法來提取淺色的葵花籽粕蛋白，進一步使用超聲波技術來改善蛋白的功能特性，以期獲得顏色和功能特性都較好的葵花籽粕蛋白，旨在為提取淺色植物蛋白和改善蛋白功能特性上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂葵花籽粕(粗蛋白質量分數)；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硫酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LCJ-25C冷凍干燥機，TAS-986 紫外可見分光光度計，GT15E高速離心機，T10高速均質機，CR-10色差儀，K116型凱氏定氮儀。

1.3 葵花籽蛋白的制備

參照武佳樂的方法[10]。將葵花籽粕粉碎，過60目篩。稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL無水乙醇1∶10(g/mL)混合攪拌均勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，收集沉淀，加750 mL(15倍)蒸餾水攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調節pH至 7.0，在50 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，用0.1 mol/L HCl調pH至4.0進行蛋白酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)收集沉淀，沉淀用20 mL蒸餾水分別水洗3次，收集沉淀用0.1 mol/L NaOH調pH至7.0，冷凍干燥即為葵花籽粕蛋白，保存備用，經凱氏定氮儀測定后其蛋白質量分數(蛋白系數為6.25)為90.76%。

1.4 大孔樹脂吸附脫色葵花籽粕蛋白的制備

參照武佳樂[10]的方法。稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化鈉溶液1∶10(g/mL)混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，加入AB-8型大孔樹脂進行吸附(12%大孔樹脂，120 min)，過濾樹脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl調節pH至3.8酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，加20 mL蒸餾水將沉淀分別水洗3次，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，冷凍干燥即為大孔樹脂吸附脫色的葵花籽粕蛋白，保存備用，經凱氏定氮儀測定后其蛋白含量(蛋白系數為6.25)為91.77%。

1.5 超聲處理脫色的葵花籽粕蛋白

根據包中宇[11]的方法處理并稍作修改。取10 g大孔樹脂吸附脫色的葵花籽粕蛋白，溶于90 mL蒸餾水中，25 ℃條件下攪拌10 h，分別取300 mL蛋白溶液裝入500 mL 燒杯中，然后選用超聲波破碎儀對葵花籽蛋白溶液進行處理。在超聲功率分別為200、400、600 W下超聲30 min；工作時間3 s，休息 3 s；超聲后冷水浴中冷卻10 min。超聲處理結束后將樣品冷凍干燥，儲藏在4 ℃備用。

1.6 色差值的測定

采用CR-10色差儀對樣品進行色差值的測定，首先對黑白板進行自動校正，自動校正完成后進入標準測量界面，按測試鍵，記錄樣品的L*、a*、b*值(取3次平均值)。

1.7 提取率的測定

根據羅豐收[12]的方法測定蛋白質提取率，并稍作修改。

1.8 溶解度的測定

根據Bera 和 Mukherjee的方法測定并稍作修改[13]，配制50 mL 1%的蛋白溶液，在25 ℃下攪拌1 h，隨后用0.1 mol/L HCl或NaOH調pH至7.0，在25 ℃下攪拌30 min后，4 000 r/min離心15 min，取上清液進使用凱式定氮儀進行蛋白含量的測定。通過公式計算：

1.9 乳化性及乳化穩定性的測定

根據Yust等[14]的方法來測定并稍作修改，用蒸餾水配制濃度為1%的蛋白樣品溶液，將15 mL蛋白質溶液與5 mL大豆油(3∶1)攪拌混合，在12 000 r/min的條件下均質2 min。分別在0 min和靜置10 min時從容器底部取50 μL乳濁液，與5 mL(0.1%)的SDS溶液混合均勻，用紫外分光光度計在波長500 nm處0 min(A0)和10 min(A10)時測定吸光度值。使用公式計算EAI(乳化性)和ESI(乳化穩定性)：

式中：DF為樣品稀釋倍數，為100倍；C為蛋白質質量/g/mL；Φ為光程，設定為0.01；θ為乳狀液的油體積分數，0.25。

1.10 起泡性及泡沫穩定性的測定

按照 Motol等[15]的方法測定并稍作修改，用蒸餾水配制1%的蛋白質樣品溶液。取50 mL樣品溶液置于高速均質機內，以 12 000 r/min的轉速攪打2 min。然后快速轉移到 100 mL 的量筒中。分別在0、30 min 時記錄起泡體積V0及V30。起泡性(FC)及泡沫穩定性(FS)通過公式計算。

1.11 持油性的測定

根據Wani等[16]的方法并稍作修改。稱0.5 g蛋白樣品記錄為m0，將樣品稱入離心管中，記錄質量為m1，加入大豆油，然后漩渦混合5 min，直到樣品被油飽和，靜置30 min，4 500 r/min離心15 min后，將上清液的油去掉，稱離心管質量記為m2。

1.12 持水性的測定

根據Wani等[16]的方法并稍作修改。稱0.5 g蛋白樣品記錄為m0，將樣品稱入離心管中，記錄質量為m1，加入蒸餾水，然后漩渦混合5 min，直到樣品被水飽和，室溫靜置30 min，4 500 r/min離心15 min后，將上清液的水去掉，稱離心管質量記為m2。

1.13 統計分析

實驗數據采用SPSS軟件進行數據分析，并判斷顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異。在Origin2017軟件上做圖，每個樣品設置不少于3個重復，實驗數據采用平均值(MEAN)±標準差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 超聲波對葵花籽蛋白色差值和提取率的影響

超聲波技術對脫色葵花籽蛋白色差值和提取率的影響見表1。色差值包括L*、a*、b*值，其中，L*值表示明度指數，L*值越高表明顏色越白，a*值與b*值表示色度，a*值為正時表示紅色，值增大則紅色增加；b*值為正時表示黃色，值增大時表示黃色增加。由表1可知，未處理葵花籽蛋白的L*、a*、b*值分別為55.7、3.8和9.9，蛋白樣品呈深灰色，AB-8型大孔樹脂吸附脫色后蛋白的L*、a*、b*值分別提高至72.2、4.1、15.1，脫色的葵花籽蛋白經超聲處理后其L*值顯著提高(P<0.05)，a*、b*值均沒有顯著變化(P>0.05)，其中在超聲功率為400 W、超聲30 min時脫色葵花籽蛋白的L*值達到最高為77.3，蛋白樣品呈淺白色。另外，從表1可以看出，大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的提取率略有降低，這可能是由于大孔樹脂吸附脫除多酚的同時部分蛋白質也被脫除，因而蛋白提取率下降。經超聲處理后隨著超聲功率的增加，脫色葵花籽粕蛋白的提取率也增加，這可能是由于超聲功率越大，超聲波的空化效應的能量越大，對細胞的破碎作用也就越強，所以蛋白溶出物就越多[12]。結果表明，超聲波對蛋白質色差值具有顯著的影響，超聲波功率對其無顯著影響，但是對于蛋白提取率超聲波功率具有顯著的作用。

表1 超聲波對脫色葵花籽蛋白色差值和提取率的影響

2.2 溶解性

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，是其他功能性質(如乳化性和起泡性)的基礎。超聲波處理對葵花籽蛋白溶解性的影響如圖1所示。未處理的葵花籽蛋白的溶解度為36.58%，經超聲處理后脫色葵花籽蛋白的溶解度顯著提高(P<0.05)，此外，蛋白質與多酚類化合物相互作用后的發生褐變變成苯酚，苯酚很容易暴露在空氣中被氧化成醌類物質，這也是導致葵花籽蛋白質的溶解度低的原因所在[17]。因此，多酚經大孔樹脂吸附脫除后溶解度也就提高了。隨著超聲功率的增加溶解度逐漸提高，其中超聲功率為600 W時其溶解度達到最高值為59.7%。一方面，溶解性增強可能是由于在超聲波處理過程中，部分蛋白質構象發生改變，強化了蛋白質水的相互作用，一些不溶性蛋白變成了可溶性蛋白，使可溶性蛋白含量增加，另一方面，超聲波的空化效應和機械效應等作用使大顆粒的蛋白聚集體解聚成較小顆粒的蛋白分子，蛋白質顆粒體積的減小，增強了在水中可壓縮性，從而使蛋白質更易分散在水中[18，19]。王小英等[20]研究了超聲波對大豆蛋白的溶解性的影響，發現在超聲功率700 W條件下超聲時間20 min，大豆蛋白的NSI可提高到72.71%，為超聲前的5.9倍。

圖1 超聲波對脫色葵花籽蛋白溶解度的影響

2.3 乳化性及乳化穩定性

超聲波對葵花籽蛋白乳化性及乳化穩定性的影響如圖2所示。未處理葵花籽蛋白的乳化性為1.71 m2/g，大孔樹脂吸附脫色后葵花籽蛋白的乳化性提高至2.61 m2/g。研究表明，多酚類物質的存在會影響葵花籽粕蛋白的乳化性，酚類成分的存在降低了葵花籽蛋白的溶解性，較高的溶解性是良好乳化性的先決條件，因此，多酚類物質被吸附脫除也是乳化性提高的原因[21]。經超聲波處理后葵花籽蛋白的乳化性顯著提高(P<0.05)。隨著超聲功率的增加呈先增加后下降趨勢，超聲功率為400 W時蛋白乳化性達到最高值為3.03 m2/g。從乳化穩定性來看，大孔樹脂吸附脫色后葵花籽蛋白的乳化穩定性達到112.8 min，與未處理的葵花籽蛋白相比提高了12.54 min，但隨著超聲功率的增加乳化穩定性開始下降。這一方面可能由于在超聲波的作用下，蛋白質分子完整性被破壞，造成空穴，分子結構變得疏松所導致[22]；另一方面，較低的超聲功率和超聲時間會使蛋白分子展開，埋藏在分子內部的疏水基團暴露，從而使乳化性增強。但當超聲功率的過大時，可能導致蛋白質變性程度增大，分子發生聚集，乳化性能下降[23，24]。朱建華等[25]研究了超聲波對大豆分離蛋白功能特性的影響，指出超聲處理后大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩定性均有一定程度的改善。其中乳化性隨功率的增加而增加，乳化穩定性隨著功率的增加先增加后趨于平緩，當功率增至300 W時乳化穩定性達最大值。結果表明，超聲波功率大小以及超聲時間長短對葵花籽蛋白乳化性及穩定性的改善是非常重要的。

圖2 超聲波對脫色葵花籽蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

2.4 起泡性及泡沫穩定性

超聲波作用對葵花籽蛋白的起泡性及泡沫穩定性的影響如圖3所示。與未處理的葵花籽蛋白相比，經超聲波處理后脫色葵花籽蛋白的起泡性和泡沫穩定性均顯著提高(P<0.05)。隨著超聲功率的增加，起泡性呈先增加后降低趨勢。當超聲功率為400 W時蛋白起泡性達到最高值為17.38%。從泡沫穩定性來看，隨著超聲功率的增加泡沫穩定性呈先增加后降低趨勢。當超聲功率為200 W時蛋白泡沫穩定性達到最高值為95.18%，比未處理和脫色的葵花籽蛋白相比分別提高了6.01%、15.46%，這是因為超聲波的空化作用和機械效應破壞了葵花籽蛋白的結構，使更多的疏水性基團暴露，因而具有更大的表面活性,同時降低了水的表面張力，使蛋白質更易在空氣和水的界面上展開，在劇烈攪拌后形成穩定性較高的泡沫[26]。李健[27]以燕麥蛋白為原料，利用超聲波技術對其進行改性，指出超聲處理能顯著提高燕麥球蛋白的溶解性、乳化性、起泡性和起泡穩定性，但超聲功率過高和處理時間過長時，燕麥球蛋白的上述功能性質反而有所下降。

圖3 超聲波對脫色葵花籽蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響

2.5 持油性

蛋白質的持油性在配方食品，如奶制品和餅千夾心中起著非常重要的作用。超聲波作用對葵花籽蛋白的持油性的影響如圖4所示。未處理葵花籽蛋白的持油性為5.24 g/g，大孔樹脂吸附脫色后葵花籽蛋白的持油性下降，這可能是由于蛋白質的疏水性在與多酚相互作用時降低，從而使持油性降低[21]。經超聲波處理后葵花籽蛋白的持油性顯著提高。其中，超聲功率為400 W時脫色蛋白的持油性達到最高值為5.50 g/g。這可能是由于蛋白質在超聲波處理下，結構變得疏松，顆粒變小，比表面積變大；同時，蛋白質結構遭到破壞，分子伸展，使埋藏在分子內部的二硫基、疏水基等功能基團暴露出來，這也使得蛋白吸附和結合脂類物質的能力更強，從而導致持油性提高[28]。邵悅等[26]研究了超聲波對花生蛋白功能特性的影響，結果發現，超聲波處理后花生蛋白的起泡性、持油性、乳化性和溶解性均顯著提高，當超聲波處理6 min時，花生蛋白的持油性從0.91 mL/g增大到1.51 mL/g。

圖4 超聲波對脫色葵花籽蛋白持油性的影響

2.6 持水性

超聲波作用對葵花籽蛋白的持水性的影響如圖5所示。由圖5可見，未處理葵花籽蛋白的持水性為1.44 g/g，經超聲波處理后葵花籽蛋白的持水性顯著提高，隨著超聲功率的增加，蛋白持水性逐漸提高，其中，超聲功率為600 W時脫色蛋白的持水性達到最高值為2.37 g/g。這一方面可能是由于蛋白樣品受到超聲波的剪切和空穴等作用下，顆粒變小，比表面積變大，吸附能力變得更強。另一方面，持水性的提高可能也與蛋白結構變得更加疏松和親水基團暴露有關[11]。此外，蛋白持水性的提高也與多酚類物質有關，多酚被大孔樹脂吸附脫除后產生了許多水結合位點，通過氫鍵結合水，從而增強了蛋白的持水性[29]。張艷艷等[30]研究了超聲波處理對花生粕蛋白功能特性和結構的影響。發現超聲波處理后的蛋白溶解性和持水性顯著提高，與對照樣品相比分別提高了5.1%和23.8%。

圖5 超聲波對脫色葵花籽蛋白持水性的影響

3 結論

與未處理的葵花籽粕蛋白相比，大孔樹脂吸附脫色后葵花籽粕蛋白的L*值、溶解度、乳化性和持水性均顯著改善，表明多酚類物質被脫除對其蛋白色澤和部分功能特性的改善是有利的。大孔樹脂吸附脫色的葵花籽蛋白經超聲波處理后其L*值和功能特性更是進一步顯著改善。隨著超聲功率的增加，蛋白的溶解度和持水性逐漸增加，當超聲功率為600 W時達到最高，表明超聲功率越大對其溶解性和持水性越好。蛋白質的L*值、乳化性、起泡性和持油性隨超聲功率的增加呈先增加后降低趨勢，當超聲功率為400 W時均達到最高。本研究表明超聲波處理可以較好地改善葵花籽粕蛋白的色澤和功能特性，未來可以更廣泛地應用于食品工業中。