抗壞血酸再生叔丁基對苯二酚抗氧化能力的研究

陳雪琪， 王夢如， 于 航， 楊方威， 郭亞輝， 成玉梁， 謝云飛， 姚衛蓉

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室；江南大學食品學院食品安全與質量控制研究所，無錫 214122)

抗氧化劑在當代生活中占有重要地位，如油脂以及含油脂類的食品在儲藏過程中不飽和脂肪酸會自動氧化導致油脂酸敗，添加抗氧化劑能夠有效地避免油脂類食品在運輸、儲藏過程中發生酸敗、褐變等，在生活、工業等各個領域均有廣泛的應用。抗氧化劑按其來源通常可分為天然和合成兩大類[1]，常用的合成抗氧化劑有叔丁基對苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等，合成抗氧化劑憑借其活性高、抗氧化效果強、價格低廉和性價比高，在食品中廣泛使用[2]。而天然抗氧化劑作為天然綠色安全抗氧化劑，種類繁多，如維生素C、E等，已經廣泛應用于油脂和化妝品等領域。但天然抗氧化劑相比來說提取成本高、抗氧化效果不夠理想，食品企業多選擇前者作為主要的抗氧化劑。

因此很多研究開始考慮抗氧化劑之間協同作用來提高整體的抗氧化性能，實現1+1>2的效果[3]。研究表明茶多酚、維生素E等與TBHQ進行復配時，可以顯著增強TBHQ的抗氧化能力，且抗氧化效果大于單一的抗氧化劑，能夠有效延長食物保質期[4]。而且，近年來研究發現合成抗氧化劑TBHQ在抗氧化過程中的主要降解產物叔丁基對苯醌具有細胞毒性[5]，因此，通過添加天然抗氧化劑產生協同作用達到預想的抗氧化效果，降低TBHQ的使用量、從而降低有毒產物的含量成為研究的關鍵。

抗氧化劑協同再生作用的機理之一是再生作用[6-8]，在同時含有BHT和α-生育酚的非極性體系內，根據清除DPPH自由基速率發現BHT可以重生α-生育酚[9]。如在葵花籽油中同時存在α-生育酚和楊梅酮條件下，追蹤100 ℃條件下的酸價變化，α-生育酚和楊梅酮可發生協同效應，并且根據動力學分析得出α-生育酚能夠再生楊梅酮自由基[10]；在亞油酸基質中添加綠茶多酚和維生素E，分析添加抗氧化劑對亞油酸過氧化的抑制作用和過程中維生素E的降解變化，發現綠茶多酚能夠再生維生素E[11]；在花生油體系中通過電子自旋共振光譜根據初期油的氧化速率比較發現茶多酚和TBHQ的協同效應主要是茶多酚提供氫原子再生TBHQ[12]。目前研究抗氧化劑再生大多是將待研究的兩種抗氧化劑溶解在同一種氧化基質中，在同一體系采用加熱或者化學方式促進氧化來進行研究分析，通過分析在氧化過程中耗氧量和過氧化值等指標的變化，來分析抗氧化劑的保護作用[13,14]。

本實驗基于再生作用學說，構建可分離體系，而非在同一體系內研究抗壞血酸對TBHQ抗氧化能力的再生，在固相內添加抗壞血酸使液相內失去抗氧化能力的TBHQ的抗氧化能力再生。隨后分析添加抗壞血酸前后溫度對TBHQ抗氧化能力的影響以及TBHQ和氧化產物TQ的含量變化，分析其再生機理和影響因素，為協同使用抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

叔丁基對苯二酚(TBHQ，純度≥98%)，抗壞血酸標準品(純度≥99%)，1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH，純度98%)自由基標準品，甲醇(分析純)、β-環糊精(β-CD)。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外-可見光分光光度計，ZNCL-GS-C型磁力攪拌水浴鍋，DZF-6030A真空干燥箱，TGL-16M臺式高速冷凍離心機，e2695高效液相色譜(DAD/熒光)。

1.3 方法

1.3.1 抗壞血酸與β-環糊精包合物的制備

用重結晶[15]的方法制備抗壞血酸與β-環糊精(β-CD)的包合物。稱取 30 g β-環糊精在60 ℃水浴下溶解于420 g去離子水，充分溶解后得到β-環糊精溶液。準確稱取15 g抗壞血酸溶解于150 g去離子水中制備抗壞血酸溶液。向β-環糊精溶液中恒速滴加抗壞血酸溶液，在60 ℃的磁力水浴攪拌鍋中磁力攪拌6 h。冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱隔夜結晶。過濾，漂洗，真空干燥得到固體。稱取相同質量比的抗壞血酸與β-環糊精，渦旋混合器混合5 min得到物理混合物作對照。

1.3.2 包合物的表征

1.3.2.1 紫外可見光光譜觀察

取抗壞血酸、β-環糊精以及抗壞血酸與β-環糊精的物理混合物和包合物，配制成1.0 mg/mL的溶液，稀釋后使用UV-1800型紫外-可見光分光光度計進行掃描。掃描波長范圍為200～450 nm，記錄數據。每次測量重復3次平行實驗。

1.3.2.2 掃描電鏡(SEM)觀察

將抗壞血酸、β-環糊精以及VC-β-CD樣品放在導電板上，測量前進行表面鍍金。圖像在5.0 kV下通過掃描電子顯微鏡收集。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH清除實驗參照Spínola等[16]的方法稍作修改。配制0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液和0.2 mmol/L TBHQ-甲醇溶液。取2.0 mL DPPH-甲醇溶液于5 mL離心管中，加入200 μL的TBHQ-甲醇溶液于室溫下避光反應30 min，待反應穩定后，于517 nm處紫外檢測記錄吸光度。抗氧化能力(AC)按照式(1)計算：

(1)

式中：A0為對照組吸光度；A1為樣品組吸光度值；Aj為空白組吸光度。

1.3.4 抗壞血酸對TBHQ和TQ作用后的抗氧化作用

將所需摩爾比的TBHQ和DPPH溶液在黑暗中以300 r/min搖動30 min后，梯度按照0、0.2、0.4、0.8、1.0 g添加VC-β-CD于反應溶液中進行反應；梯度添加0、0.2、0.4、0.6、0.8 g包合物于標準TQ溶液中反應。將樣品放置黑暗狀態300 r/min搖動 2 h，1 500 r/min 離心15 min收集上清液，測定其抗氧化值。

1.3.5 不同溫度下TBHQ抗氧化能力的測定

取10 mL TBHQ-甲醇溶液置于15 mL離心管中，并添加0.6 g VC-β-CD，設為再生組。空白組中不含VC-β-CD。在4、25、38、50 ℃下，分別反應2、4、6、8、10、12 d，1 500 r/min離心15 min收集上清液，取不同溫度下溶液檢測抗氧化能力。

1.3.6 TBHQ降解動力學模型

TBHQ的降解動反應符合零級動力學模型，應用該模型擬合實驗數據如式(2)所示：

y=-kt+b

(2)

式中：t為反應時間；y為某時間溶液的抗氧化能力；k為反應速率常數，k值由Origin 8.5通過線性擬合函數進行計算。

1.3.7 樣品的制備

制備166 mg/L的TBHQ溶液，添加0.6 g含抗壞血酸的固相包合物為再生組，不添加的為空白組；制備164 mg/L的TQ標準溶液，添加0.8 g含抗壞血酸的固相包合物構建可分離體系。

1.3.8 HPLC分析

使用2487 紫外檢測器的 HPLC 系統用于分析：色譜柱為SunFire C18柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)；流動相比例為甲醇∶含0.5%乙酸的水=65∶35；柱溫為35 ℃，TBHQ或者TQ的進樣量為10 μL；UV檢測器設置檢測波長為280 nm[17]。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次以上，結果以“平均值±標準偏差”表示，采用SPSS20軟件進行數據統計對實驗數據進行單因素方差分析，檢測實驗數據之間是否具有顯著性差異。若顯著性差異值P<0.05，則表示兩者有顯著性差異。數據繪圖采用Origin8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 抗壞血酸與β-環糊精固相包合物的表征

將抗壞血酸與β-環糊精制備成固相包合物(VC-β-CD)，跟蹤了其紫外吸收情況。從圖1抗壞血酸譜圖可知在259 nm處抗壞血酸有最大吸收峰，該峰是由π-π*躍遷產生的吸收帶。從β-環糊精譜圖中可以看出在225 nm處有較弱吸收峰，是羥基n→σ*躍遷所致。在278 nm處也有一較弱吸收峰，是環糊精的單氧非共軛生色團所致[18]。物理混合物從譜圖看在259 nm出現最大吸收峰，基本與抗壞血酸的紫外吸收一致。抗壞血酸與β-環糊精固相包合物的紫外表征如圖1所示，可以看出VC-β-CD譜圖中在259 nm處也有最大吸收峰，掩蓋了β-環糊精在278 nm處的吸收峰[19]。該包合物在225 nm處有吸收峰，與β-CD較為一致，但吸收強度顯著減弱，這有可能是β-CD與抗壞血酸通過氫鍵相互作用力相互結合，從而形成包合物。

注：a為抗壞血酸與β-環糊精物理混合；b為抗壞血酸；c為抗壞血酸與β-環糊精包合物；d為β-環糊精。圖1 抗壞血酸與β-環糊精固相包合物的紫外表征

抗壞血酸與β-環糊精固相包合物電鏡掃描圖如圖2所示，抗壞血酸呈現規則塊狀，β-環糊精表現出不同尺寸表面粗糙的晶體結構，VC-β-CD則呈現表面覆蓋非晶碎片的不規則晶體形狀，這與單獨的抗壞血酸和β-CD相比形狀和大小有明顯不同。包合物表面出現粗糙的點蝕區，純抗壞血酸與β-CD獨有的形貌消失，說明抗壞血酸和β-CD包合之后在形狀顆粒上發生了變化[20]。SEM圖和紫外圖譜結合證實了包合物的形成。

圖2 抗壞血酸與β-環糊精固相包合物電鏡掃描圖

2.2 可分離體系中TBHQ抗氧化能力的再生

DPPH是一種氮為中心的穩定自由基，其孤對電子可與抗氧化劑提供的質子進行配對，從而造成孤對電子在紫外波長517 nm處的吸收峰逐漸降低直至消失[21]。

為確定抗壞血酸對TBHQ的再生作用，添加適量的DPPH于TBHQ溶液中進行反應，當DPPH自由基剛好全部捕獲TBHQ提供的質子，TBHQ溶液完全失去抗氧化能力[22]。TBHQ溶液抗氧化能力的再生如圖3所示，由圖3a可知，隨著溶液中DPPH/TBHQ摩爾比的增加，TBHQ溶液的抗氧化能力逐漸下降。當溶液中DPPH與TBHQ摩爾比為1.98時，溶液沒有抗氧化能力，此時溶液中TBHQ提供的質子恰好被DPPH自由基全部捕獲。

圖3 TBHQ溶液抗氧化能力的再生

對抗氧化能力被完全猝滅的TBHQ溶液進一步

研究，觀察有無添加VC-β-CD后溶液抗氧化能力的變化。從圖3b可以看出，不添加VC-β-CD時溶液沒有抗氧化能力；添加質量為0.2 g時，溶液的抗氧化能力就恢復到原來的67.78%；且隨著添加量的增加，恢復的抗氧化能力顯著性增加(P<0.05)。當添加質量達到0.6 g時，溶液抗氧化能力達到峰值，可恢復到原來的92.70%。隨著添加量的繼續增加，溶液的抗氧化再生能力達到飽和不再增加。由此可知VC-β-CD能夠使TBHQ抗氧化能力再生，且抗氧化能力再生效果與VC-β-CD添加量有關，推測抗壞血酸能夠提供質子來使TBHQ再生。

2.3 可分離體系中溫度對TBHQ抗氧化能力再生的影響

50 ℃下TBHQ抗氧化能力的變化趨勢均如圖4所示，其他溫度條件下TBHQ抗氧化能力的變化趨勢與之相同。TBHQ的抗氧化動力學參數見表1。同一溫度下，隨著時間的增加，再生組和對照組的TBHQ抗氧化能力都在逐漸降低，且隨時間變化關系符合一級反應動力學模型(R2均大于0.9)，但再生組中TBHQ的抗氧化能力始終高于空白組。不同溫度下，再生組抗氧化能力比空白組的平均下降速率下降了17.60%。由此可知，添加抗壞血酸包合物能夠有效地延緩甲醇溶液中TBHQ的抗氧化能力。

表1 TBHQ的抗氧化動力學參數

圖4 50 ℃下TBHQ抗氧化能力的變化

隨著溫度的上升，TBHQ抗氧化能力的下降速率更快，且與溫度具有高度相關性(r=0.912 8)，說明高溫會促進TBHQ抗氧化能力的再生。

2.4 TBHQ再生機理分析

TBHQ在加熱情況下接觸氧氣直接被氧化成叔丁基對苯醌(TQ)，也可以在失去2個氫質子后生成TQ[23]。溶液的液相色譜圖如圖5所示，通過HPLC方法觀察再生前后溶液中TBHQ和TQ含量的變化，TBHQ的出峰時間為3.64 min，TQ的出峰時間為8.24 min。采用外標法定量得到，再生組中TBHQ對應的質量濃度為6.692 mg/L，TQ為19.05 mg/L；空白組中TBHQ質量濃度為4.83 mg/L；TQ為21.44 mg/L。由此可得再生組TBHQ含量高于空白組，TQ含量低于空白組。由此推測包合物中的抗壞血酸能夠將TQ還原成TBHQ。

圖5 溶液的液相色譜圖

根據DPPH自由基清除實驗來檢測添加固相包合物后TQ溶液的抗氧化能力。TQ溶液中抗氧化能力的變化如圖6所示，TQ溶液的初始抗氧化能力為0，隨著固相包合物添加量的增加，溶液的抗氧化能力顯著增加(P<0.05)；當添加質量為0.8 g時，溶液的抗氧化能力達到19.93%。由TQ的結構可知，TQ本身沒有抗氧化能力，無法提供游離的質子或者轉移電子給DPPH自由基。添加固相包合物于溶液中使抗壞血酸與TQ進行界面反應，從而溶液具有抗氧化能力，由此推斷抗壞血酸能夠與TQ發生反應。

圖6 TQ溶液中抗氧化能力的變化

TQ溶液中TBHQ和TQ含量的變化如圖7所示，初始狀態時TQ溶液中沒有TBHQ生成。隨著時間的增加，溶液中TQ的含量逐漸下降(P<0.05)，TBHQ的含量逐漸增加(P<0.05)。在室溫下使固相包合物中的抗壞血酸與TQ反應4、8 d時，TQ的含量從初始164.2 mg/L分別降低到154.32、128.22 mg/L；TBHQ含量從初始不存在增加到8.12、22.29 mg/L。由此可以確定抗壞血酸可以將TQ還原成TBHQ。

圖7 TQ溶液中TBHQ和TQ含量的變化

擬合方程及相關系數見表2，TQ的降低速率高于TBHQ的生成速率，說明部分TQ被還原成TBHQ，由此可以證明固相包合物中的抗壞血酸能夠將部分TQ還原成TBHQ，使得溶液具有抗氧化能力。有研究通過觀察室溫和熱處理條件下大豆油中的TBHQ和TQ變化，發現油中的某些具有還原能力的物質能夠使TQ還原成TBHQ[24]，與本實驗結論一致。

表2 擬合方程及相關系數

3 結論

本實驗選取可分離體系對TBHQ的抗氧化能力進行研究，證明TBHQ的抗氧化能力可被抗壞血酸再生。通過研究固相包合物中抗壞血酸與甲醇溶液中的TBHQ在界面上的反應來評估TBHQ的再生效果。研究發現添加VC-β-CD能使TBHQ抗氧化能力再生，且隨著添加量的增加，TBHQ抗氧化能力再生效果增強。再生組比空白組抗氧化能力的下降速率均明顯減緩，平均下降速率降低17.60%，且下降速率與溫度具有高度相關性(r=0.912 8)，說明在0～50 ℃范圍內升高溫度能促進TBHQ的再生。追蹤TBHQ和TQ含量變化及TQ溶液的抗氧化能力變化，確定抗壞血酸能夠將部分TQ還原成TBHQ；由此推測包合物中的抗壞血酸能夠提供質子使TQ還原成TBHQ，從而實現對TBHQ抗氧化能力的再生。