基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶水解酶對肝纖維化的調控及相關治療藥物研究進展

黃 倩， 楊 燕， 曾 銳， 姚孟林， 孫 琴,2

1 西南醫科大學 a.藥學院， b.中西醫結合學院， 四川 瀘州 646000;2 西南醫科大學附屬中醫醫院 中西醫結合藥物研究中心， 四川 瀘州 646000

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展的共同病理過程。病毒感染、免疫或自身免疫疾病、飲酒、遺傳及藥物等均可能成為肝纖維化的誘發因素[1]。在這些因素作用下，正常肝細胞變性、壞死，產生炎癥反應，最終刺激纖維組織增生而形成肝纖維化。

肝臟內彌漫性細胞外基質(ECM)的沉積是肝纖維化的主要病理特征，其表現為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達遠高于正常水平[2]。ECM生成與水解的平衡是由基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)與基質金屬蛋白酶水解酶(tissue inhibitors of metallopro-teinases, TIMP)調控的，當TIMP與MMP的表達失衡時，ECM的沉積可能加重，進而可能加快或加重肝纖維化[3]。現階段肝纖維化的治療十分困難，目前尚無基于病理生理學治療肝纖維化的藥物，僅有扶正化瘀膠囊、復方鱉甲軟肝片、安絡化纖丸、強肝膠囊/丸、安琺特及肝爽顆粒等幾個中成藥被批準基于適應證用于肝纖維化治療[4]。新藥的研發有賴于潛在治療靶點和潛在活性成分的發掘，故本文基于中國知網、萬方醫學網、中國生物醫學文獻數據庫、維普數據庫、PubMed及Web of science等數據庫，總結了近5年來基于MMP/TIMP的肝纖維化實驗研究及相關報道，分析通過MMP/TIMP發揮抗肝維化活性的組分及其作用機制，以期闡明MMP/TIMP與肝纖維化的關系，為肝纖維化治療靶點的發現及抗肝纖維化藥物的開發提供新的線索和理論支撐。

1 MMP與TIMP的結構、分類及功能

1.1 MMP的結構、分類及功能 MMP由鋅依賴性蛋白水解酶組成，可以降解ECM的組成成分，如層粘連蛋白、膠原、纖連蛋白等組分。MMP有3個共同的結構區域，分別是具有“半胱氨酸開關”的前肽結構域、具有HEXGHXXGXXHS序列的催化鋅結合的結構域和類血紅素蛋白結構域[5]。

目前為止，已經發現28種不同類型的MMP，其中至少有23種在人體組織中表達，其中結構研究較為明確的共有22種，可被分為7類(圖1)[6]；作用底物研究較為明確的共有21種，可被大致分類6類(表1)。

注：信號肽、前肽及具有活化鋅的催化結構是MMP的共性結構。

表1 MMP主要功能分類表

MMP具有降解細胞外基質蛋白、糖蛋白、膜受體及細胞因子等生物功能，可參與組織修復和再生、胚胎形成和發育、血管生成及傷口愈合等多種生物過程。MMP的表達或活性異常時，常常伴隨著不同疾病的發生，肝纖維化的發生與發展主要與MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-9等幾種酶的活性有關[7]。

1.2 TIMP的結構、分類及功能 TIMP是MMP家族的抑制劑，由184～194個氨基酸組成，分子量為25～31 kD[8]。現代研究已發現的TIMP包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四類。TIMP-3的表達較為廣泛，TIMP-1、TIMP-2主要在肝臟組織中表達，TIMP-4則只在腦、心臟、卵巢和骨骼肌等組織中少量表達。4種不同亞型的TIMP均能在一定程度上抑制MMP的活性，但其在結構上卻存在一定的差異，如TIMP-2與TIMP-4在結構上具有一定的相似性，而TIMP-1的結構較為獨特。TIMP-1主要抑制膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)的活性，同時TIMP-1可能對細胞的生長有一定的調節作用;TIMP-2過量時會抑制明膠酶原A的激活，但適量 TIMP-2對于明膠酶原A的激活似乎是必不可少的; TIMP-3能誘導腫瘤細胞和血管平滑肌細胞凋亡，TIMP-4的功能目前尚未明確[8]。

2 MMP/TIMP對肝纖維化的調控

2.1 MMP在肝纖維化中的作用 目前肝內發現的MMP共有8種，分別是MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12及MMP-13[9]，它們可直接或間接調控ECM的降解，在肝纖維化的形成與消退過程中有重要作用。MMP-1為間質膠原酶，主要對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ膠原有較強的水解作用。有研究[10]表明，適當上調MMP-1的表達在一定程度上可以減緩肝纖維化的進程。MMP-2是一種明膠酶，由活化的肝星狀細胞(HSC)產生。而MMP-2的激活，是由MMP-14介導，其通過與Pro-MMP-2和TIMP-2在HSC細胞膜上形成三元聚合而發生。較多研究[11]認為，MMP-2在纖維化階段表達量升高，而在肝硬化與肝纖維化逆轉過程中逐漸降低。MMP-3在HSC活化的早期短暫表達，其可以通過剪切短肽的形式激活多種金屬蛋白酶，包括MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9和MMP-13等，對肝纖維的發生與發展有間接調控作用。而在急性和慢性肝損傷動物模型中，MMP-9的表達結果不一致。在單次注射CCl4引起的急性肝損傷中，注射后3 d內活性MMP-9增加，而24 h后MMP-9基因表達無變化。在8周CCl4注射方案誘導的慢性肝損傷中，既沒有觀察到MMP-9 mRNA表達的變化，也沒有觀察到活化的MMP-9的出現。而在膽管結扎誘導的肝纖維化大鼠模型中，檢測到Pro-MMP-9的上調，這表明MMP-9對肝纖維化的影響與炎癥之間存在一定程度上的關聯[12]。

2.2 TIMP在肝纖維化中的作用 迄今為止，已知有4種TIMP對肝纖維化的形成有不同程度的影響。TIMP-1與TIMP-2和肝纖維化的相關性初次發現是在炎癥刺激下的大鼠肝細胞中；隨后，在CCl4、膽管結扎誘導的大鼠肝纖維化模型中發現TIMP-1和TIMP-2的表達增強，再次證實兩者與肝纖維的相關性[13]。慢性肝損傷動物模型強調TIMP-1對肝纖維發展的重要性[14]，過量表達TIMP-1的轉基因小鼠與野生型小鼠相比，經CCl4處理后表現出更加嚴重的肝纖維化癥狀。另一方面，TIMP-1由TGFβ調控，其本身并不能誘導纖維化的發生。TIMP-1主要通過與MMP結合抑制膠原酶的活性，以免新合成的膠原被MMP立即降解，同時TIMP-1也能夠阻止活化的HSC中前體基質金屬蛋白酶的激活[12]。顯然，TIMP-1在肝纖維化的調控中起著重要作用。TIMP-2與TIMP-1的表達情況類似，在原代培養的HSC中不表達，當HSC被活化后表達增強[14]。研究[15]發現在肝纖維化形成過程中MMP-2的表達增高,而TIMP-2的表達水平顯著低于MMP-2，從而使MMP-2的活性得不到抑制，而促進肝纖維化的不斷形成和發展。

2.3 MMP/TIMP對肝纖維化的調控 肝纖維化的發病機制復雜，多種因素均可能誘發肝纖維化。目前研究認為，肝纖維化的發生與消退是由多種細胞因子與信號通路構成的復雜網絡共同調控的[16]。MMP/TIMP對肝纖維化形成與消退的影響與巨噬細胞關系密切，巨噬細胞在不同趨化因子的影響下可形成M1/M2型兩種類型的巨噬細胞，進而影響ECM的合成和水解[17]。另外，活化的HSC中TIMP-1的表達上調，MMP的活性受到抑制，ECM的降解減少，最終形成了ECM的過度沉積，進而導致肝纖維化的發生。而M1型巨噬細胞則在膠原纖維的溶解中起著重要作用。M1型巨噬細胞分泌MMP-9，可以通過調控HSC的凋亡，減少TIMP-1的分泌進而增強MMP的活性，以促進ECM的降解，另外M1型巨噬細胞還可以分泌MMP-13、MMP-12等細胞因子，增強對ECM的水解作用，進而抑制肝纖維化的進程[17]。

MMP與TIMP在肝臟中維持著一種平衡的狀態，當有過量ECM產生時， MMP會將其降解，同時TIMP又適當抑制著MMP的活性，不至于損傷正常肝臟組織，兩者共同維護著肝細胞微環境的穩態。一旦有致病因子打破這種統一，則使兩者失衡，從而導致肝纖維化的形成與發展。

3 基于MMP/TIMP發揮抗肝纖維化作用的藥物

隨著對MMP/TIMP在肝纖維化機制中的認識，基于MMP/TIMP發揮治療肝纖維化的藥物研究逐漸增加，不少現代藥理學研究表明，許多藥物可以通過影響肝組織中MMP/TIMP的表達來減緩肝纖維化的進程，從而發揮抗肝纖維化的作用。本綜述從實驗模型對MMP/TIMP的影響等方面將近5年報道的組分整理匯總，以期為闡明不同組分發揮抗肝纖維化的作用機制提供支持。

3.1 基于MMP/TIMP發揮抗肝纖維化作用的化學藥物 由于肝纖維化發病機制的復雜，針對單一靶標研發的藥物在臨床很難奏效，截至目前尚無療效明確的化學藥物或生物藥物可供臨床應用。但近年來有實驗研究發現美洛昔康、尼洛替尼及氯沙坦3種藥物可能通過調節MMP/TIMP而在肝纖維化模型上發揮治療作用。Hassan等[18]基于CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型研究發現，美洛昔康通過降低模型組大鼠中TIMP-1、TGFβ的表達而抑制膠原的沉積進而減輕肝纖維程度。據Karimi等[19]學者研究，尼洛替尼和氯沙坦聯用通過上調CCl4誘導的肝纖維化大鼠中MMP-2、MMP-9的表達發揮抗肝纖維化作用。

3.2 基于MMP/TIMP發揮抗肝纖維化作用的中藥 中藥在治療肝纖維化方面較西藥更具優勢，其多環節、多靶點的作用特點使之成為了肝纖維化藥物研究的熱點[20]。近年在中藥復方的實驗研究中，李潔等[21]基于CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型，發現加味茵陳四逆湯可以通過上調MMP-1及下調TIMP-1、TIMP-2的表達而減輕肝纖維的程度。李紹民等[22]研究認為，逍遙散含藥血清可使體外肝纖維化模型細胞表現出MMP-1上調及TIMP-1下調。另有研究[23-25]表明，柴胡疏肝散、鱉甲煎丸及清肝九味丸可以通過下調TIMP-1及上調MMP-2、MMP-9的表達發揮抗纖維化的活性。

除中藥復方外，單味中藥在基于MMP/TIMP抗肝纖維化的實驗研究中進展迅速，如荔枝核總黃酮、籽瓜皮提取物、金釵石斛多糖、鱉甲提取物、溪黃草黃酮、白背葉根水提物、豆莢提取物等均被報道有上調MMP及下調TIMP而減緩肝纖維化進程的作用[26-31]。

3.3 基于MMP/TIMP發揮抗肝纖維化作用的天然產物 近年來，從天然產物中尋找或發現抗肝纖維化藥物和先導化合物已成為熱門的研究領域。總結近5年的實驗研究共發現14種天然產物可通過調控MMP/TIMP發揮抗肝纖維化的作用(表2)。這些天然產物在不同因素引誘的肝纖維模型中均可通過調控MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13或TIMP-1、TIMP-2的表達進而發揮抗肝纖維化的作用，此外這些組分還調節其他肝纖維化相關細胞因子(如TGFβ1、TNFα等)的表達進而影響肝纖維化的進程。

表2 近5年基于TIMP與MMP發揮抗肝纖維化的天然產物研究情況

綜上，本文通過總結近5年來基于MMP/TIMP發揮抗肝纖維化作用的文獻報道，共計發現相關藥物30種，包括中藥復方、單味中藥及提取物、化學藥物及天然產物等，從構成比來看，中藥及天然產物相關組分在MMP/TIMP介導的纖維消融平衡中有重要作用， 該結果與文獻報道的中醫藥治療肝病尤其在肝纖維化防治領域療效顯著一致[47]。 從作用機制來看它們主要是通過不同程度的調節MMP/TIMP的表達，尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13與TIMP1/2等的表達而發揮抗肝纖維化的作用。總體來說，中藥具有成分復雜、功效復雜等特點，與肝纖維化復雜的作用機制相適應，在肝纖維化的治療上優勢顯著，不少研究也證實多種組分可以通過調控關鍵蛋白、關鍵靶標及相關信號通路減輕肝纖維化的程度。但仍有許多問題值得注意：(1)中藥來源復雜、處理過程考究，因此某些活性物質的含量在不同研究中可能存在較大差異，會對不同研究結果的比較與分析造成一定的困擾。(2)由于肝纖維化的動物模型及體外實驗研究的局限性，雖然抗肝纖維化藥物的實驗研究結果可觀，但最終療效及安全性仍需通過細致嚴格的臨床實驗驗證篩選。(3)由于中藥組分及功效的復雜性以及在治療肝纖維化上的多層次、多靶點優勢，使得闡明中藥復方抗肝纖維化的機制仍具有極大的挑戰。

4 總結與討論

肝纖維化是多種肝病共同且可逆的病理過程，預防和治療肝纖維化對于防控肝硬化及肝癌有重要意義。由于肝纖維化的發生和發展是由多種因子及信號通路共同調控，極具復雜性，而且動物模型的作用機制與人類肝纖維化的發病機制存在一定的差異性，故目前治療肝纖維化的藥物大都處于臨床前的研究階段，鮮有臨床驗證有效的藥物。

但隨著對肝纖維化作用機制研究的不斷深入，MMP/TIMP在肝纖維化中的作用引起了學者們的廣泛重視。現有研究發現MMP/TIMP可以不同程度地反映肝纖維化及肝硬化的進展情況，MMP/TIMP調控的膠原消融平衡，對早期診斷肝纖維化及逆轉肝纖維化有著重要的意義；同時研究表明肝纖維化的治療已經從抗炎治療發展為以HSC為靶細胞的多模式結合治療。ECM的沉積是肝纖維化的一個重要特征，MMP可以降解ECM的不同組分，其天然抑制劑TIMP能與MMP的成員發生不同形式的結合而抑制其活性，通過抑制膠原合成及促進膠原的降解減少ECM的沉積，進而減慢肝纖維化的進展或逆轉肝纖維化。但目前MMP/TIMP在肝纖維化發生發展過程中對ECM的調控作用、如何精準維持MMP/TIMP、調節MMP的活性、闡明MMP/TIMP平衡的機制等方面還需深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：黃倩、楊燕對研究的思路或設計有同等的關鍵貢獻；曾銳、張馨月、姚孟林參與了研究數據的獲取分析解釋過程；孫琴起草或修改文章關鍵內容。