芍甘附子湯加味對膠原誘導性關節炎大鼠肺間質病理及血清KL-6、IL-6 與IL-17 表達水平的影響

席雅婧，康天倫，錢唐亮，侯秀娟，朱躍蘭*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院風濕科，北京 100078）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以累及關節滑膜為主的系統性自身免性疾病。間質性肺?。╥nterstitial lung disease，ILD）是類風濕關節炎最常見、最嚴重的關節外表現之一。類風濕關節炎相關間質性肺?。╮heumatoid arthritis associated with interstitial lung disease，RA-ILD）在類風濕關節炎患者中的發病率為10%～50%[1-2]，病死率為10%～20%，平均生存期為5～8 年[3-4]，嚴重影響患者的生活質量和生命健康。芍甘附子湯加味是課題組在經典方劑芍藥甘草附子湯的基礎上化裁而來，在臨床[5]及動物實驗[6]中均驗證了其有效性。本研究擬探討芍甘附子湯加味對KL-6、IL-6 等致纖維化細胞因子的影響及作用，為芍甘附子湯加味緩解類風濕關節炎相關間質性肺病的發生發展提供一定的實驗理論依據。

1 實驗材料

SPF 級雌性Wistar 大鼠60 只，鼠齡6～8 周，體質量100～110 g，由北京華阜康動物有限技術公司提供，清潔動物房適應性喂養1 周。加味芍甘附子湯藥物組成：白芍、生甘草、制附片、青風藤、雞血藤，藥材購買于北京中醫藥大學東方醫院，并由制劑室代煎，并將以藥液水浴蒸發方法濃縮，使濃縮后的藥液濃度按小、中、大劑量分別為0.443、0.885 g/mL 和1.770 g/mL。后將藥液于4 ℃冰箱保存。雷公藤多苷片每片10 mg，源自湖南千金協力藥業，用蒸餾水將其配制成濃度為0.625 mg/mL 的藥物混懸液。包埋機器（武漢俊杰公司），脫水機（武漢俊杰公司），病理切片機（上海徠卡公司），組織攤片機（浙江科迪公司），烤箱（上?；厶┕荆?，正置光學顯微鏡（日本尼康公司），成像系統（日本尼康公司），全自動多功能酶標儀（美國Thermo公司），電熱恒溫培養箱（天津泰斯特公司）。牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，貨號20022），不完全弗氏佐劑（Sigma 公司，貨號7002），戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司），蘇木素-伊紅染液（武漢皮諾飛公司，貨號PN0004），大鼠IL-6、IL-17 ELISA 試劑盒（multisceience 公司，貨號分別為70-EK306/3-96、70-EK317/3-96），大鼠KL-6 ELISA 試劑盒（BG 公司，貨號BG20201108Ra）。

2 方法

2.1 造模與分組 將60 只SPF 級雌性Wistar 大鼠隨機分為空白組10 只，造模組50 只?？瞻捉M予以正常飲食喂養，直至試驗結束。造模組依據徐淑云《藥理學實驗方法》建立膠原誘導性關節炎模型鼠，成功率約為80%。具體制備方法為：將牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑（IFA）混合，制備成濃度為2 mg/mL 的混合物，使用高速分散器混勻，最終形成滴入水中而不散的“油包水”狀，隨后在大鼠左足和尾根部分別多點皮內注射0.1 mL，同時按壓注射部位使其充分吸收。1 周后取0.1 mL 于大鼠尾根部加強免疫1 次。第2 周末將造模成功的40 只大鼠隨機分為5 組，每組8只，分別為對照組、大、中、小劑量中藥組及雷公藤組。空白組與對照組蒸餾水灌胃，其余4 組分別給予相對應的藥物進行灌胃，大劑量組17.70 g/（kg·d），中劑量組8.85 g/（kg·d），小劑量組4.43 g/（kg·d），雷公藤組6.250 mg/（kg·d）。連續灌胃4 周。所有大鼠在第6 周末處死，用2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定大鼠腹主動脈取血，離心后收集血清-80 ℃保存。將取完血后的大鼠沿腹部正中線剪開充分暴露胸腔，鈍性分離出肺組織及支氣管，沖洗后將肺組織浸泡在4%的多聚甲醛中固定。

2.2 ELISA 法檢測血清KL-6、IL-6 與IL-17 水平 具體方法，設標準孔、待測樣品孔與空白孔3 組，3 組分別加入不同濃度的標準品100 μL、測樣品100 μL 和標準品稀釋液100 μL，酶標板覆膜，予37 ℃溫育1 h，甩干板內液體。每孔加入A 工作液 100 μL，37 ℃溫育1 h，棄去液體，甩干，隨即加入B 工作液重復上述操作。最后每孔加TMR 底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15～20 min，終止反應。用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的光密度值（OD 值）。繪制標準曲線，計算IL-6、IL-17、KL-6 表達水平。

2.3 HE 染色法觀察大鼠肺間質病理變化 將浸泡在4%的多聚甲醛中固定的肺組織，固定48 h 后，進行包埋、切片、脫蠟、HE 染色、脫水、封片，光鏡下觀察各組大鼠肺間質的病理變化。用Szapiel評分[7]標準進行評分。無肺泡炎0 分；輕度肺泡炎，受累面積小于全肺20%，肺泡結構正常1 分；中度肺泡炎，受累面積20%～50%，近胸膜部較重2分；重度肺泡炎，受累面積超過50%，偶見肺泡腔內有單核細胞3 分。2.4 統計學方法 所有數據均運用SPSS 20.0 軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（）來表示，符合正態分布的數據，采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊時多重比較用Bonferroni,方差不齊時多重比較用Tamhane；不符合正態分布則采用非參數秩和檢驗（Mann-Whitney U）。

3 結果

3.1 血清IL-6、IL-17、KL-6 的表達 血清細胞因子IL-6、IL-17、KL-6 在對照組中均顯著升高（P＜0.01）。3 個相關指標在各治療組均有降低，其中IL-6 在中劑量組與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）；IL-17在中劑量組與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）；KL-6 在各治療組與對照組相比差異均具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。中、大劑量中藥組與雷公藤組對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠血清指標比較（，n =8）pg/mL

表1 大鼠血清指標比較（，n =8）pg/mL

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 大鼠肺間質病理比較 空白組大鼠肺組織結構及肺泡壁完整，未見明顯炎性細胞浸潤；對照組大鼠肺組織結構大面積破壞，肺泡結構塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現大量纖維瘢痕；中藥小劑量組肺泡炎仍然較為明顯，肺泡結構紊亂，肺泡間隙仍較寬，較對照組有所改善；中藥中、大劑量組及雷公藤組肺泡結構較為清晰，伴有輕微炎癥反應及少量纖維增生，與對照組相比有較明顯的改善（見圖1）。從肺泡炎評分來看（如表2），對照組與空白組炎癥反應有明顯區別（P＜0.01），中藥中大劑量組與對照組相比肺泡炎癥和纖維化均顯著下降（P＜0.01）,且與中藥小劑量組也有明顯差異（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺間質HE 染色結果（×100）

表2 HE 染色Szapiel 評分

4 討論

類風濕關節炎是一種復雜且纏綿難愈的自身免疫性疾病。類風濕關節炎相關間質性肺病是類風濕關節炎肺部受累最常見的表現形式，同時對患者呼吸系統損傷最為嚴重，預后較差[8]。目前，類風濕關節炎相關肺間質病變的發病機制尚不明確，但吸煙已是誘導類風濕關節炎發展為類風濕關節炎合并間質性肺病的公認致病因素，吸煙的類風濕關節炎患者將比不吸煙的患者增加3 倍以上患間質性肺病的機會[9]。此外，與類風濕關節炎診斷相關的抗體類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸（CCP）抗體的持續升高會增加類風濕關節炎患者患間質性肺病的風險，抗環瓜氨酸抗體可能是類風濕關節炎合并間質性肺病的獨立危險因素[10-12]。

類風濕關節炎的發病過程受多種細胞因子影響，多種炎性細胞因子促成了以調節類風濕關節炎病理過程為主的細胞因子網絡，其中一部分細胞因子同時可作用于肺引起間質性肺病。涎液化糖鏈抗原（Krebs Von den Lungen-6,KL-6）是一種與肺泡上皮和肺間質損傷相關的抗原，主要表達于Ⅱ型肺泡細胞，能夠促進成纖維細胞增殖和遷徙，誘導肺間質病變的發生和發展，在多種結締組織病相關間質性肺病患者血清中發現KL-6 升高[13]。此外，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素6（IL-6）也與結締組織病相關間質性肺病有關。Zhang Jie 等[14]發現與特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）或正常肺組織相比，類風濕關節炎相關間質性肺病患者肺活檢組織中成纖維細胞聚集和纖維化區域的IL-17表達顯著增加。這表明IL-17在肺纖維化中的直接作用，同時可能與類風濕關節炎相關間質性肺病特別相關。魯錦玥等[15]也發現IL-17 的表達水平在伴有和不伴有間質性肺病的類風濕關節炎患者中有顯著差異，提出IL-17 可以作為類風濕關節炎相關間質性肺病的監測指標。

類風濕關節炎屬于中醫“痹證”的范疇。“風寒濕”三氣雜至合而為痹，因風寒濕氣的側重不同分為風、寒、濕痹。本課題認為在臨床中因寒致痹的患者具有一定的臨床特點[5]，且與文獻報道結果相一致[16]。芍藥甘草附子湯是張仲景《傷寒論》中的名方，在其基礎上加上雞血藤、青風藤構成芍甘附子湯加味。方中附子配合甘草辛甘化陽，芍藥配甘草酸甘化陰，雞血藤配合青風藤補血活血兼通經絡?，F代藥理研究[17]發現，青風藤也有調節免疫的作用，青風藤中的青藤堿可以降低IL-1、IL-6 的水平，顯著改善類風濕關節炎的關節病理損傷程度。課題組前期研究發現，芍甘附子湯加味在類風濕關節炎寒證患者中療效較好[5]；動物實驗也證明芍甘附子湯加味可通過調節膠原誘導性關節炎大鼠關節滑膜組織中的JAK/STAT 通路[6]以及大鼠血清中IL-1β、TNF-α 等細胞因子來緩解疾病的進展[18]。間質性肺病作為類風濕關節炎的合并癥與類風濕關節炎的病理過程密切相關，芍甘附子湯加味能否延緩類風濕關節炎相關間質性肺病的進展值得研究。

本研究中，大鼠血清細胞因子IL-6、IL-17、KL-6水平對照組較空白組顯著升高（P＜0.01），說明在RA 發病過程中一些與致纖維化有關的細胞因子也隨之升高，這些細胞因子的產生增多可能促進了類風濕關節炎相關間質性肺病的發生發展，這與上述相關文獻描述相一致。同時在對大鼠肺臟病理改變的觀察中發現，對照組較空白組體現出明顯差異，空白組大鼠肺組織結構及肺泡壁完整，未見明顯炎性細胞浸潤；對照組大鼠肺組織結構大面積破壞，肺泡結構塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現大量纖維瘢痕。本研究還發現，芍甘附子湯加味干預的模型鼠中IL-6、IL-17、KL-6 較對照組均有明顯降低，其中KL-6降低的水平較另外兩個細胞因子更為明顯，且在中藥組大、中、小劑量組與對照組相比差異都具有統計學意義。柳玉佳等人的研究也發現KL-6 在RA-ILD 患者血清中明顯升高，同時中藥可以下調KL-6 的水平[19]。同時芍甘附子湯加味干預的模型鼠肺臟病理均較空白組有改善，以中、大劑量中藥組改善更為明顯。

綜上所述，芍甘附子湯加味可顯著抑制IL-6、IL-17、KL-6 的高表達，這可能是芍甘附子湯加味防治類風濕關節炎相關間質性肺病的有效作用機制之一。