基于網絡藥理學和生物信息學探討健脾益氣方治療免疫性血小板減少癥作用機制

姚軼敏 李 強

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是臨床上最常見的自身免疫性出血性疾病，血小板破壞增加及生成減少是其主要表現，可導致皮膚黏膜出現瘀點、瘀斑、內臟出血甚至腦出血，危及生命。中醫將ITP 稱為“紫癜病”，屬于中醫“血證”等范疇，臨床以“脾氣虛弱，氣不攝血”為基本病機，這也是健脾益氣法治療ITP 的理論依據[1]。中醫或中西醫結合治療ITP 有獨特優勢，經激素治療無效或復發的患者臨床上采用中醫治療常可獲得良好的臨床療效。但對于健脾益氣法治療ITP 的藥效機制，尚缺乏足夠的現代醫學理論依據及有力的實驗室證據。健脾益氣方是在健脾方的基礎上加減藥味而成，組方為黨參、甘草、茯苓、黃芪、茜草、白術、阿膠[2]，可以健脾、補氣、養血，促進血液循環，在臨床實踐中被用于治療ITP[3-4]。目前，對于該復方制劑的作用途徑和作用靶點尚不清楚，這是限制其廣泛應用的主要因素。在本研究中，利用網絡藥理學和生物信息學來鑒定和篩選健脾益氣方治療ITP 可能的機制和關鍵靶點。

1 資料與方法

1.1 健脾益氣方藥物活性成分及作用靶點的篩選通過中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM 數據庫檢索出健脾益氣方中黨參、甘草、茯苓、黃芪、茜草、白術、阿膠7 種中藥的化學成分。根據藥物動力學參數（ADME）對化學成分進行篩選，篩選標準：口服利用度（OB）≥30%，化合物類藥性（DL）≥0.18。BATMAN-TCM 根據分數截止值為20，預測的候選目標（包括已知的目標）其得分不小于20，多次測試校正后設置P 值的截止值（調整后的P 值）小于0.05。將TCMSP 數據庫和BATMAN-TCM 數據庫篩選到的各味中藥的活性成分進行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣方主要活性成分。將篩選到的活性成分通過PubChem 數據庫進行SMILES 晶體結構查詢，將不能查詢到晶體結構的活性成分進行剔除，將查詢到的各活性成分晶體結構上傳到SwissTargetPrediction 數據庫進行靶點預測。然后通過Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）將篩選出的靶點名稱轉化為Gene Symbol，并進行標準化，刪除檢索結果中重復的靶點，建立活性成分靶點數據集，備用。

1.2 ITP 疾病靶點的獲取 以“immune thrombocytopenia”作為關鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）以及DisGenet（https://www.disgenet.org/）數據庫中進行檢索，獲取ITP 相關的疾病靶點。然后通過Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）將篩選出的靶點名稱轉化為Gene Symbol，并進行標準化，刪除檢索結果中重復的靶點，建立疾病靶點數據集，備用。

1.3 關鍵靶點篩選及構建蛋白相互作用（PPI）網絡應用R 語言（涉及的R 包：ggplot2 包，用于可視化），將健脾益氣方活性成分靶點和ITP 相關的疾病靶點進行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣組分與ITP 交集靶標，即為健脾益氣方治療ITP 的關鍵靶點。將關鍵靶點在STRING 數據庫在線平臺（https://stringdb.org/）構建PPI 網絡，限定研究物種為“homo sapiens”，最低相互作用評分設為“medium confidence”（＞0.4），其余參數保持默認設置，獲得PPI網絡，下載PPI 網路TSV 文件備用。

1.4 關鍵靶點基因功能（GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將藥物-疾病共同基因用R 語言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可視化）進行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化。

1.5 TOP10 GO 注釋和KEGG 通路富集分析 為了進一步篩選到可能的關鍵靶點，我們將關鍵靶點PPI網路TSV 文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件處理，通過Cytoscape 中的cytohubba 插件來評估程度。cytohubba 目前有12 種算法，各種算法之間沒有優劣，本研究使用最新的MCC 算法，得到分數前十的基因，并用R 語言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可視化）進行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化，得出健脾益氣方治療ITP 的關鍵靶點和通路。

1.6 健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點 為了探討健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點，我們將健脾益氣方治療ITP 的關鍵靶點與從人類自噬數據庫中共獲得基因（http://www.autophagy.lu/）進行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣方治療ITP 自噬相關交集靶標，即健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點。

1.7 健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點GO 注釋和KEGG 通路富集分析 健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點用R 語言進行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化。

1.8 構建健脾益氣方各味中藥-活性成分－自噬相關靶點網絡 將中藥、活性成分及自噬相關靶點整理后導入Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化分析。

1.9 推測健脾益氣方治療ITP 自噬相關可能的關鍵靶點 為了進一步分析健脾益氣方治療ITP 自噬相關關鍵靶點，我們將22 個活性成分的靶點分別與健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點進行映射，韋恩得到各活性成分治療ITP 自噬相關靶點，根據靶點的計數，獲得健脾益氣方治療ITP 自噬相關可能的關鍵靶點。

2 結果

2.1 健脾益氣方活性成分-靶點網絡的構建 根據篩選標準，在TCMSP 數據庫中和BATMAN-TCM 數據庫共篩選出健脾益氣方中7 味中藥及35 種活性成分，其中黨參7 種、甘草8 種、茯苓2 種、黃芪5種、茜草3 種、白術7 種、阿膠3 種（見圖1）。在Pub－Chem 數據庫進行SMILES 晶體結構查詢，其中22 種中藥活性成分查詢到了SMILES 晶體結構（見表1）。在SwissTargetPrediction 數據庫進行靶點預測，所有成分得到靶點去除重復后有763 個。

圖1 5 種中藥在TCMSP 數據庫和BATMAN-TCM 數據庫中的共同活性成分韋恩圖

表1 健脾益氣方活性成分信息

2.2 ITP 疾病靶點的篩選及共同靶點PPI 網絡構建 通過GeneCards、DrugBank 以及DisGenet 數據庫進行檢索，刪除檢索結果中重復的靶點，獲得ITP相關的疾病靶點3130 個。將這3130 個疾病靶點與763 個健脾益氣方活性成分的作用靶點用R 語言繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得疾病-活性成分共同靶點337 個，此即健脾益氣方治療ITP 有重要意義的靶點（見圖2A）。在STRING 數據平臺輸入337 個共同靶點，分析后得到PPI 網絡圖（見圖2B）。

圖2 健脾益氣方活性成分的作用靶點與ITP 相關的疾病靶點的韋恩圖（A）；337 個共同靶點PPI 網絡圖（B）

2.3 337 個關鍵靶點GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 為了分析這些共同靶點的潛在生物學功能，我們用R 語言對健脾益氣方活性成分-ITP 疾病的337 個共同靶標進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可視化（見圖3）。337 個共同靶點在生物過程方面，主要富集在肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽基絲氨酸修飾；在細胞組分方面，主要富集在膜筏、膜微區、膜區；在分子功能方面，主要富集在蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性；KEGG 通路方面，主要富集在EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、前列腺癌、PI3K/Akt 信號通路。

圖3 健脾益氣方活性成分-ITP 疾病的337 個共同靶標GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網路圖

2.4 TOP10 靶基因GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 根據MCC 算法，得到分數前十的基因是CCND1、BCL2L、CASP3、HSP90AA1、JUN、SRC、STAT3、MTOR、HIFA1、VEGFR，用R 語言對關鍵共同靶標進行GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析，得到GO 和KEGG 富集結果及富集分析圖（見圖4）。TOP10 共同靶點在生物過程方面，主要富集在抗生素反應、髓樣細胞分化、上皮細胞增殖的正調控；在細胞組分方面，主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合物、谷氨酸能突觸；在分子功能方面，主要富集在泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、組蛋白去乙酰化酶結合；在KEGG通路方面，主要富集在癌癥中的蛋白多糖、胰腺癌、PI3K/Akt 信號通路。

圖4 根據MCC 算法，得分前十的健脾益氣方治療ITP 關鍵共同靶標（A）及其GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網路圖（B）

2.5 健脾益氣方治療ITP 自噬相關靶點GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 健脾益氣方治療ITP 的關鍵靶點與從人類自噬數據庫中共獲得基因進行映射，得到健脾益氣方治療ITP 自噬相關交集靶標36 個（見圖5A）。將36 個共同靶標進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可視化（見圖5B）。36 個共同靶標在生物過程方面，主要富集在肽基絲氨酸修飾、肽基絲氨酸磷酸化、細胞對氧化應激的反應；在細胞組分方面，主要富集在富含ficolin-1顆粒、膜筏、膜微區；在分子功能方面，主要富集蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白脫乙酰酶結合、MAP 激酶活性；在KEGG 通路方面，主要富集在自噬、凋亡、胰腺癌。

圖5 健脾益氣方治療ITP 自噬相關交集靶標韋恩圖（A）；36個健脾益氣方治療ITP 自噬相關共同靶標GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網路圖（B）

2.6 健脾益氣方各味中藥-活性成分－自噬相關靶點網絡 應用Cytoscape 3.7.2 軟件對中藥、活性成分、自噬相關靶點進行可視化分析，得到中藥-活性成分－自噬相關靶點網絡圖，見圖6。

圖6 中藥-活性成分－自噬相關靶點網絡圖

2.7 健脾益氣方治療ITP 自噬相關可能的關鍵靶點 根據靶點計數分析，EGFR、PARP1、MTOR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等是健脾益氣方治療ITP 自噬相關可能的關鍵靶點，見圖7。

圖7 健脾益氣方各活性成分治療ITP 自噬相關靶點計數柱狀圖

3 討論

研究表明，ITP 患者的血小板自噬減少，血小板自噬通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路進行調控[5]。升高的血小板自噬可能通過抑制血小板凋亡和提高血小板活力來延長ITP 患者血小板的壽命[5]。此外，自噬在巨核細胞生成、血小板生成和血小板功能中的新作用在血小板減少癥患者中也已得到揭示[6]。這些提示通過對ITP 患者自噬調節有可能為ITP 治療提供新的方向。

臨床實踐提示，健脾益氣方在改善ITP 患者出血癥狀及調節免疫等方面具有良好的療效[7]，但對于健脾益氣方治療ITP 的具體藥效機制，尚缺乏足夠的現代醫學理論依據及有力的實驗室證據。研究表明，黨參的有效活性成分豆甾醇可以通過抑制Akt/mTOR 途徑同時誘導胃癌細胞凋亡和保護性自噬[8]。雷帕霉素（mTOR）介導的自噬的哺乳動物靶標被鑒定為甘草有效活性成分葛蘭素的潛在介質之一，通過保護軟骨細胞免受氧化應激，細胞凋亡和促進mTOR 介導的自噬，保護特性軟骨免受骨關節炎損傷的影響[9]。甘草和黃芪共同有效活性成分山奈酚與mTOR 抑制劑的作用相似，它可通過抑制人內皮細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路上調自噬，從而減輕ox-LDL 誘導的細胞凋亡[10]。甘草和黃芪共同有效活性成分槲皮素通過Akt/mTOR 途徑介導的自噬誘導對細胞遷移和糖酵解產生抑制作用[11]。茯苓有效活性成分茯苓酸，增加了老化細胞中與自噬相關的蛋白如LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達，并降低了mTOR 磷酸化[12]。我們認為健脾益氣方中黨參、甘草、黃芪、茯苓中的有效活性成分可充當mTOR 抑制劑的作用，通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路上調自噬，特別是甘草和黃芪中的多個有效活性成分有自噬誘導作用。因此，我們猜想健脾益氣方通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路靶向自噬可能為ITP 的治療提供新的方法。

在本研究中，我們通過網絡藥理學和生物信息信息學研究健脾益氣方治療ITP 的藥理學機制。網絡藥理學分析得到22 種化合物，337 個關鍵靶點，多條靶基因調控途徑以及TOP10 靶基因。MTOR 基因主要編碼激酶mTOR，mTOR 是調節細胞自噬的關鍵蛋白，細胞缺氧、應激都可直接或間接通過mTOR 調節細胞自噬的發生[13]。此外，PI3K/Akt 通路是調節mTOR 的主要上游信號通路之一。最近的研究表明，ITP 中的血小板自噬受PI3K/Akt/mTOR 通路調節，mTOR 作為負調節因子，Ⅲ類PtdIns3K 在該過程中起關鍵作用[14]。增強血小板自噬通過抑制細胞凋亡和提高血小板活力來減輕血小板破壞。因此我們可以推測，ITP 患者存在PI3K/Akt/mTOR 異常導致自噬功能減輕，而健脾益氣方有可能通過對ITP 血小板的自噬調節從而起到治療作用。

為了進一步探討健脾益氣方有可能通過哪些關鍵靶點調節血小板自噬治療ITP，根據各活性成分靶點計數分析，EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等可能是健脾益氣方治療ITP 調節自噬的關鍵靶點。EGFR 是一種酪氨酸激酶，可將細胞外信號與細胞存活、生長、增殖和分化的控制聯系起來，已證明EGFR 是自噬具有細胞保護或細胞毒性作用的關鍵決定因素。EGFR 下游的PI3K/AKT1 軸可以通過調節自噬抑制劑mTOR 來調節自噬[15]。PARP1 可修復DNA 中的單鏈斷裂，并在自噬調節中起重要作用。PARP1 是DNA 損傷、活性氧和饑餓誘導的自噬的重要積極調節因子。PARP1 激活和三磷酸腺苷耗竭通過AMPK 激活和mTOR 抑制介導細胞死亡和自噬[16]。BCL2L1 是線粒體中的一種跨膜分子，被認為是自噬的重要因子，通過與Beclin-1 結合抑制Beclin-1 介導的自噬[17]。RAF1 是MEK/ERK信號傳導的上游調節因子，Raf/MEK/ERK 激活引起LC3B 和SQSTM1 表達增加，LC3B 和SQSTM1是關鍵的自噬標志物[18]。LC3B 作為一種RNA 結合蛋白和mRNA 衰減子發揮作用，是高效自噬所必需的[19]。SQSTM1 又名p62，是最早被研究發現的自噬接頭蛋白，在選擇性自噬中起著至關重要的作用[20]。BCL2 是自身免疫性疾病、腫瘤或損傷中自噬和細胞凋亡之間的交叉點。此外，大量研究表明BCL2 參與了多種疾病的細胞凋亡和自噬。這種參與取決于含有BCL2 的復合物的形成，在細胞應激條件下，BCL2 的減少導致與Beclin-1 的結合減少，游離Beclin-1 增加，從而促進自噬[21]。而目前的結果表明，與正常血漿相比，ITP 血漿中Beclin-1 下調，而BCL2上調[22]。HDAC6 是一種獨特的Ⅱ類HDAC，研究表明HDAC6 可通過調節PI3K/Akt/mTOR 通路減輕朊病毒肽介導的神經元死亡，這種保護作用涉及自噬的激活和mTOR 信號轉導的PI3K/Akt 哺乳動物靶點的調節[23]。EGFR、PARP1、MOTR、HDAC6 通過調節PI3K/Akt/mTOR 信號通路來靶向自噬，而RAF1、BCL2L1 和BCL2 作為自噬的重要因子調節自噬。所以，我們認為健脾益氣方治療ITP，可能通過調節PI3K/Akt/mTOR 信號通路或調節自噬的關鍵蛋白來完成。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和生物信息學分析表明，傳統中醫藥組分健脾益氣方通過調節PI3K/Akt/mTOR 信號通路或自噬的關鍵蛋白來靶向自噬可能為ITP 提供一種有前景的治療方法。EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6等分子可能是健脾益氣方誘導自噬，抑制血小板凋亡，治療ITP 的關鍵靶點。但其具體的調控機制和關鍵的靶點還有待實驗研究進一步證實。