基于網絡藥理學探討膽寧片治療慢性膽囊炎的活性成分及其分子作用機制Δ

楊 提，王 雪，楊云云，丁 楠，王學彬,4#，陳井霞#

(1.上海市浦東新區公利醫院藥劑科，上海200135； 2.海軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，上海 200433； 3.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016； 4.復旦大學藥學院生物藥物系，上海 201203)

慢性膽囊炎一般是由長期存在的膽囊結石或急性膽囊炎反復發作遷延不愈導致的膽囊慢性炎癥。根據膽囊內是否存在結石，分為結石性膽囊炎和非結石性膽囊炎。目前，慢性膽囊炎以西藥及手術治療等為主，但結石殘余率、復發率高，手術并發癥及再手術的發生風險較高。有研究結果表明，中藥治療慢性膽囊炎的臨床效果顯著且遠期療效可觀[1]。中藥膽寧片的主要成分為大黃、虎杖、青皮和山楂等7味中藥，具有消炎利膽、防石護肝、清熱通下之功效，對于慢性膽囊炎具有較好的治療效果，是為數不多的具有防石溶石作用的純中藥制劑。雖然膽寧片在治療慢性膽囊炎和預防膽固醇結石形成中有一定的療效，但其作用靶點仍不明確[2]。網絡藥理學分析是在系統生物學與多向藥理學的基礎上提出的新思想、新策略，能夠系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預和影響，尤其適用于“多成分-多靶點-多通路”的中藥藥理學研究[3]。本研究通過網絡藥理學方法，探討膽寧片治療慢性膽囊炎的藥物作用靶點，為膽寧片后續藥理作用研究提供基礎理論。

1 資料與方法

1.1 膽寧片活性成分及潛在靶點獲取

膽寧片由大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根等7味中藥組成，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)和草本組鑒數據庫(HERB)(http://herb.ac.cn/)檢索中藥膽寧片的化學組分。口服生物利用度(OB)指化合物在給藥后，吸收進入血液循環系統的相對量，是決定化合物是否具有分子類藥性的關鍵指標；類藥性(DL)反映化合物的結構特征及理化性質，可用于評估生物分子作為藥物的可能性。因此，根據網絡藥理學系統特點，以OB≥30%且DL≥0.18為條件，篩選具有生物活性的化合物及其作用的蛋白質靶點，并導入Uniprot蛋白質數據庫(http://www.uniprot.org)得到標準化的蛋白質靶點信息。

1.2 慢性膽囊炎相關靶點的獲取

以“gallbladder”和“chronic cholecystitis”為關鍵詞，分別在GeneCards數據庫(http://www.GeneCards.org)、DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)及Drugbank數據庫(https://go.drugbank.com/)中檢索，得到慢性膽囊炎相關靶點。在GeneCards數據庫中，Score值越高，靶點與疾病之間的關聯越密切，以相關性分值≥5分作為篩選條件，對檢索到的慢性膽囊炎靶點進行重整，再合并檢索結果去重后，最終獲得慢性膽囊炎相關靶點。

1.3 膽寧片作用于慢性膽囊炎相關靶點的預測

利用Venny 2.1繪制膽寧片-慢性膽囊炎靶點韋恩圖，得到藥物-疾病共有靶點，即膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點。

1.4 膽寧片所含化合物與慢性膽囊炎相關靶點相互作用的網絡構建

將每個化學成分與其作用的慢性膽囊炎靶點相聯系，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建膽寧片成分-慢性膽囊炎相關靶點相互作用網絡并繪制網絡圖，利用軟件中的內置工具包NetworkAnalyzer分析網絡節點度和介數中心度。

1.5 膽寧片治療慢性膽囊炎靶點蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

將“1.3”項下所得共有靶點輸入STRING平臺(http://www.string-db.org/)，設定物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“medium confidence”(>0.4)，其余設置均為默認設置，構建膽寧片-慢性膽囊炎靶點PPI網絡圖。再將PPI網路數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，通過Cytoscape 3.7.2內置工具包NetworkAnalyzer分析PPI網絡拓撲學參數，并根據網絡拓撲學參數篩選核心靶點，再利用R語言軟件中count.R插件統計篩選出的核心靶點在PPI網絡中的出現頻次分布情況。

1.6 基因本體(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

GO對基因和蛋白質功能進行限定和描述，將基因功能分為3個部分，即細胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)[4]。KEGG是一個整合基因組、化學和系統功能信息的數據庫[5]。應用R語言軟件中Cluster Profiler GO.R插件及Perl語言對膽寧片活性成分及藥物-疾病共有靶點進行GO分析和KEGG通路富集，對結果進行可視化分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的生物功能和信號通路。

1.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.2構建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網絡圖，利用Cytoscape 3.7.2內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度、介度及緊密度等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 結果

2.1 膽寧片的主要活性成分和潛在靶點

通過TCMSP數據庫和HERB數據庫對中藥膽寧片大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根分別進行檢索，篩選OB≥30%且DL≥0.18的活性成分及相應的作用靶點，得到活性成分32種，潛在作用靶點251個。

2.2 慢性膽囊炎相關疾病靶點獲取

通過GeneCards數據庫、DisGeNET數據庫及Drugbank數據庫分別檢索關鍵詞“gallbladder”和“chronic cholecystitis”以獲取疾病靶點，合并搜索結果后刪除重復靶點，得到361個慢性膽囊炎相關靶點。

2.3 膽寧片活性成分與慢性膽囊炎的共有靶點

將上述篩選所得的膽寧片活性成分靶點與慢性膽囊炎相關靶點取交集，并通過Venny 2.1繪制韋恩圖，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點60個(見圖1)及其對應的潛在活性化合物24種，根據共有靶點與活性化合物化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

圖1 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.4 膽寧片靶點-慢性膽囊炎相互作用網絡

將候選化學成分與慢性膽囊炎靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件構建膽寧片成分靶點-慢性膽囊炎靶點群網絡，得出膽囊片靶點-慢性膽囊炎網絡主要由84個節點(24個化合物節點，60個靶點節點)和257條邊組成，其中三角形節點表示膽寧片藥物活性成分，圓形節點表示膽寧片可能是通過這些基因治療慢性膽囊炎，連接化合物與靶點的每條邊表示膽寧片活性成分與慢性膽囊炎靶點之間的相互作用關系，見圖2。在膽寧片靶點-慢性膽囊炎靶點網絡中，膽寧片中有24種主要成分作用于慢性膽囊炎相關靶點，充分體現了其多成分、多靶點的作用特點。其主要的化合物有槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川陳皮素(nobiletin)、木犀草素(luteolin)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毒扁豆次堿(physovenine)、橘皮素(tangeretin)和大黃酸(rhein)等，所屬活性成分可能膽寧片是治療慢性膽囊炎的物質基礎。

圖2 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點網絡圖Fig 2 Network diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.5 PPI網絡構建

將藥物-疾病共有靶點60個輸入STRING平臺得到膽寧片-慢性膽囊炎共有靶點PPI網絡圖(40個節點，455條邊)，見圖3。應用R語言count.R統計出現頻率前15位的蛋白靶點，其中出現頻率較高的有腫瘤蛋白p53(TP53)、白細胞介素6(IL-6)和血管內皮生長因子A(VEGFA)等，見圖4。

圖3 膽寧片與慢性膽囊炎共有靶點PPI網絡圖Fig 3 Network diagram of protein-protein interaction (PPI) of shared targets of Danning tablets and chronic cholecystitis

2.6 GO功能分析與KEGG富集分析結果

通過GO分析得到BP、CC和MF 3類，并根據信號通路中基因所占總體輸入基因的比率進行排列，篩選出前15位，見圖5(A—C)。如圖5(A)所示，膽寧片治療慢性膽囊炎主要涉及的BP為上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、細胞的氧化應激反應(cellular response to oxidative stress)和細胞的化學應激反應(cellular response to chemical stress)等；如圖5(B)所示，治療的關鍵靶點主要作用于核膜(nuclear membrane)、囊腔(vesicle lumen)和頂端質膜(apical plasma membrane)等；如圖5(C)所示，主要涉及的MF為受體配體活動(receptor ligand activity)、信號受體活動(signaling receptor activity)和生長因子受體結合(growth factor receptor binding)等。

根據通路基因所占總體輸入基因的比率排序，展示排序居前20的信號通路，見圖5(D)。膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點主涉及的信號通路主要包括膀胱癌(bladder cancer)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，體現了膽寧片多成分、多靶點、多通路的作用特點，見表2。

2.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.2構建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網絡，見圖6。運用Cytoscape 3.7.2內置的Network Analyzer分析膽寧片治療慢性膽囊炎網絡拓撲學參數，得到核心成分及核心作用靶點。結果表明，槲皮素(quercetin)連接度為32，介度為0.242 652，緊密度為0.652 174，預測槲皮素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分；其次為木犀草素(luteolin)、川陳皮素(nobiletin)和蘆薈大黃素(aloe-emodin)，見表3。TP53在網絡中的連接度為22，介度為0.076 612，緊密度為0.571 429，預測TP53為膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點；Cyclin依賴性激酶抑制劑1(CDKN1A)、G1/S-特異性Cyclin-D1(CCND1)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(RAF1)、表皮生長因子受體(EGFR)、VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、受體酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)和視網膜母細胞瘤相關蛋白1(RB1)亦為相對重要的靶點，見表4。

表3 膽寧片主要活性成分網絡節點特征參數Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of cholinester tablets

表4 膽寧片主要活性成分靶點網絡節點特征參數Tab 4 Characteristic parameters of targets network nodes of main active ingredients in Danning tablets

3 討論

慢性膽囊炎最典型的癥狀為間歇性膽絞痛，是由膽囊結石阻塞膽囊管的反復發作所致，最終由于膽囊壁的增厚和硬化導致膽囊萎縮并喪失生理功能。我國缺乏全國性的慢性膽囊炎、膽石癥流行病學資料。一項覆蓋24個省市的針對體檢人群的調查結果顯示，我國不同年齡段人群膽囊結石的患病率為1.1%～11.2%，50歲以上中老年人為膽囊炎患病的主要人群[6]。慢性膽囊炎容易復發，為消化系統疾病中治療費用較高的疾病。

膽寧片為臨床治療膽石癥和膽囊炎的有效中藥制劑，具有調節膽汁成分、抑制膽石結石的作用。研究結果表明，膽寧片可能通過促進膽汁酸、卵磷脂的分泌，降低膽汁黏稠度，減少膽汁中膽固醇的含量[7]；同時，可降低膽汁中游離膽紅素的含量，從而防止膽色素結石的形成及增大[8]。

根據Cytoscape網絡分析膽寧片成分與疾病靶點-通路網絡圖，結果表明，槲皮素、木犀草素、川陳皮素和蘆薈大黃素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分，其中槲皮素可能是最主要的有效成分。槲皮素是自然界中廣泛存在的多醇羥基黃酮類化合物，具有抗惡性腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保護和免疫調節等多種藥理學活性[9]。慢性膽囊炎多為慢性結石性膽囊炎，而膽固醇代謝異常引起的膽囊膽固醇結石是引起慢性膽囊炎的主要病因，槲皮素可以通過促進膽固醇向膽汁酸的轉化，促進體內膽固醇外排，抑制膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶的表達，進而降低總膽固醇及膽固醇酯含量[10-11]。

通過構建膽寧片與慢性膽囊炎的共有靶點PPI網絡，以及膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網絡，對結果進行分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點為TP53，其次為CDKN1A、CCND1、RAF1、EGFR、VEGFA、TNF、MMP9、ERBB2和RB1等。TP53基因表達異常與惡性腫瘤的發生密切相關，TP53能結合并激活細胞分裂制動基因，從而抑制細胞的增殖和分化。研究結果表明，少數慢性膽囊炎壁肥厚伴重度異型上皮增生病例表現出TP53基因陽性[12]。在慢性膽囊炎中，TP53基因的轉化突變可能與膽囊癌的發生密切相關[13]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)能夠在G1期調節細胞周期的功能，該基因的表達受到TP53的嚴格控制[14]；并且，TP53參與包括鱗狀細胞癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤的病理生理過程[15]。然而，CDKN1A在慢性膽囊炎病理生理學過程中的作用還未見報道。

A.GO-BP功能富集；B.GO-CC功能富集；C.GO-MF功能富集；D.KEGG通路富集A.GO-BP function enrichmen; B.GO-CC function enrichment; C.GO-MF function enrichment; D.KEGG pathway enrichment圖5 膽寧片治療慢性膽囊炎潛在靶點的GO功能富集和KEGG通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Danning tablets in the treatment of chronic cholecystitis

本研究根據GO和KEGG富集分析結果，可以得出膽寧片在慢性膽囊炎治療中參與的生物過程和信號通路。其中主要涉及的生物過程包括上皮細胞增殖、細胞的氧化應激反應和細胞的化學應激反應等；主要參與的信號通路包括膀胱癌信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路和PI3K-Akt信號通路等，涉及CCND1、CDKN1A、EGFR、MYC、TP53和IL-6等靶基因，以上通路與細胞的生長、增殖和分化等密切相關[16]。IL-6是由184個氨基酸組成的多功能糖蛋白，在慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中呈高表達狀態，其作為一種炎癥細胞因子，反映了機體對炎癥及感染的反應狀態[17-18]。膽囊局部的炎癥反應是膽囊炎發病的重要基礎，有效控制炎癥對治療膽囊炎具有明顯的促進作用。EGFR在膽囊癌組織中的陽性表達率為70.7%，在膽囊不典型增生組織中的陽性表達率為85.7%，而在正常膽囊組織中沒有陽性表達，推測EGFR與慢性膽囊炎和膽囊癌的發生可能有密切關系[19]。

綜上所述，通過網絡藥理學研究方法，得到膽寧片治療慢性膽囊炎可能與抗炎、調節膽固醇代謝相關。目前僅通過網絡藥理學對膽寧片參與治療慢性膽囊炎的主要靶點、生物過程和重要信號通路進行探討，為進一步闡明膽寧片治療慢性膽囊炎的作用機制提供了理論基礎。但是，基于網絡藥理學方法自身的局限性以及藥方中各味中藥材組分在煎煮過程中發生化學反應的復雜性，本研究并未將膽寧片原有的活性成分經過體內代謝后仍具有活性的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學技術分析結果為基礎，后續將在此分析結果的基礎上進一步篩選并在動物或細胞水平進行實驗驗證，進而明確膽寧片調控慢性膽囊炎的主要靶點。