人參皂苷Rh2和Rg3對胃癌細胞增殖和侵襲的影響Δ

劉元媛，王 歡，周 平，劉海林

(1.重慶兩江新區第一人民醫院藥劑科，重慶 401147； 2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400010)

胃癌的發生率在惡性腫瘤中居第4位[1]。胃癌的發生和發展是遺傳、壞境和表觀遺傳等多種因素作用的過程，與抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及多種分子水平和基因水平的變化密切相關[2-3]。對于胃癌的治療通常以手術和輔助放化療為主，但對于晚期侵襲和轉移的患者治療效果不佳。人參皂苷Rh2和Rg3是人參抗腫瘤的主要活性成分[4]。相關研究結果表明，人參皂苷Rh2和Rg3可以誘導細胞分化，阻滯細胞周期，抑制轉移，誘導凋亡，調節免疫功能等[5]。程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)為腫瘤免疫逃逸機制的核心調控分子，在適應性免疫抵抗中發揮著重要作用[6]。慢性感染引發T細胞持續性活化可促使PD-L1大量表達，影響T細胞的增殖能力和殺傷活性，導致T淋巴細胞耗竭[7]。因此，本研究選取人參皂苷Rh2和Rg3為研究對象，初步探討其對胃癌細胞系MGC-803增殖和侵襲的影響，并探討可能的發生機制。

1 材料

1.1 實驗細胞

胃癌細胞系MGC-803(中國科學院上海細胞典藏庫)。

1.2 儀器

CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；高速冷凍離心機(德國 Eppendorff 公司)；蛋白質印跡電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thertno Scientific公司)；Transwell小室(美國Corning公司)。

1.3 藥品與試劑

人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3(吉林大學有機化學教研室，質量分數>98%，批號：201808-1)；PD-L1載體質粒(美國Merck Millipore公司，批號：NAF1321)；RMPIA 1640培養基、胎牛血清(美國Gibco公司，批號：J17008、181221)；蛋白裂解液RIPA(上海碧云天生物技術有限公司，批號：9224)；胎牛血清(吉瑪基因公司，批號：A115121)；Trizol試劑(上海生工生物工程有限公司，批號：180519)；顯色液、BCA試劑(美國TaKaRa公司，批號：190215、190127)；RNA提取試劑盒(廣州拓科達生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(廣州威佳科技有限公司，貨號：556129)；Lipofectamine 2000轉染試劑盒(美國Invirogen公司)；Annexin V-FTIC/PI試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 細胞的培養及分組處理

于450 mL的RMPIA 1640培養基中加入濃度為10%的胎牛血清50 mL、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素5 mL，把胃癌細胞MGC-803加入培養基中，在5% CO2培養箱中培養，溫度保持在37 ℃。處于對數生長期的細胞，經胰酶消化處理，以3 000 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，然后去上清液，培養基重懸細胞后置于培養箱中常規培養，24 h以后更換液體。

將胃癌細胞MGC-803分為對照組、Rh2+Rg3組和Rh2+Rg3+PD-L1組。未經過人參皂苷Rh2和Rg3處理的MGC-803細胞設為對照組。確定藥物對細胞的半抑制濃度(IC50)，Rh2+Rg3組給予40 μg/mL混合有Rh2和Rg3的培養基，培養細胞24 h。將轉染PD-L1載體質粒以3×103的密度經過質量濃度為40 μg/mL的人參皂苷Rh2和Rg3處理的MGC-803細胞設為Rh2+Rg3+PD-L1組，具體轉染操作參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒的操作說明書。

2.2 細胞計數試劑盒8(CCK-8)法檢測胃癌細胞MGC-803的增殖情況

采用CCK-8法檢測胃癌細胞MGC-803的增殖情況，觀察Rh2+Rg3和PD-L1對胃癌細胞增殖的調節作用。加入40 μg/mL的人參皂苷Rh2和Rg3或者PD-L1載體質粒以3×103的密度轉染細胞，接種在96孔板上，并在37 ℃和5%CO2中孵育。每隔24 h，向每個孔中加入CCK-8溶液，至第5日結束，并使用酶標儀測定450 nm波長下的細胞數。最終，生成5 d的細胞生長曲線。

2.3 定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測胃癌細胞MGC-803中PD-L1 mRNA表達

各組的胃癌細胞MGC-803轉染 48 h后，進行收集，采用Trizol法從細胞中提取總RNA，利用反轉錄試劑盒從上述RNA反轉錄cDNA，最后利用由武漢巴菲爾公司合成PD-L1引物和GAPDH引物在應用生物系統7500實時PCR系統上進行PCR實驗，反應條件為95 ℃預變性4 min，90 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，60 ℃延伸20 s，共設置45個循環。PD-L1引物序列：5′-ACCGGTTTACTGTCGCAT-3′(正向)和3′-CCTCTGCTCTGT GGGC-5′(反向)；GAPDH引物序列：5′-GATGAACTCCCA CAGTGC-3′(正向)和5′-TCTGAGAGGC AGGGATG-3′(反向)，按照試劑盒的使用說明書進行嚴格操作，采用ABI 7500實時PCR進行測量，采用2-ΔΔCt法計算PD-L1的相對表達量，以GAPDH為內參。

2.4 蛋白質印跡法檢測胃癌細胞MGC-803中PD-L1蛋白表達

各組的胃癌細胞MGC-803轉染 48 h后，進行收集，通過加入RIPA裂解緩沖液進行裂解，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉膜完全后拿出PVDF膜，5%脫脂奶粉中封閉1 h，PD-L1(1∶500稀釋)一抗孵育，4 ℃冰箱中放置一夜，HRP二抗(1∶5 000稀釋)避光孵育1 h，TBST洗3次，滴加ECL發光液，凝膠成像儀拍照顯影。

2.5 Annexin-V檢測胃癌細胞MGC-803的凋亡情況

將各組的胃癌細胞MGC-803接種于6孔板中72 h后，進行細胞收集，洗涂、固定和透化，按照Annexin V-FTIC/PI試劑盒說明書的操作步驟進行細胞染色，應用流式細胞儀檢測，用FlowJo軟件處理數據。

2.6 克隆形成實驗

將各組的胃癌細胞MGC-803接種于瓊脂覆蓋的培養基的96孔板上，細胞在37 ℃的CO2培養箱中培養72 h，12 d后，使用Leica CTR MIC顯微鏡捕獲每個孔中胃癌細胞的克隆圖像，并使用Image J 1.49軟件量化克隆數量。

2.7 Transwell檢測胃癌細胞MGC-803的遷移情況

將Transwell小室取出，棄液體，PBS漂洗5 min，再用4%多聚甲醛固定15 min，在胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養24 h，將100 μL細胞(1×105/mL)接種至24孔板中，然后放入含有20% FBS的RPMI-1640 600 μL，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞或未侵襲的細胞，遷移的細胞或入侵細胞用70%甲醛溶液固定30 min，并使用0.1%的結晶紫染色20 min，使用顯微鏡捕獲每個孔中遷移的細胞的圖像。

2.8 Transwell檢測胃癌細胞MGC-803的侵襲情況

Matrigel膠稀釋，取50 μL加入Transwell上室內，37 ℃培養箱中過夜，將Matrigel膠吸出，PBS沖洗，將各組的胃癌細胞MGC-803以1×104/mL接種于上室，孵育24 h，加入無血清培養液，下室加入含20%FBS培養液，孵育48 h，去除Transwell小室內的培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，1%結晶紫染色侵襲的細胞，室溫下放置20 min后，PBS沖洗，選取5個視野，倒置顯微鏡下觀察，比較侵襲的細胞數目。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 各組胃癌細胞MGC-803增殖能力情況

第1日，三組胃癌細胞MGC-803的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；第2—3日，Rh2+Rg3組的細胞增殖能力明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；第4—5日，Rh2+Rg3組的細胞增殖能力明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1的細胞增殖能力明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

3.2 各組胃癌細胞MGC-803中PD-L1的表達情況

Rh2+Rg3組胃癌細胞MGC-803中PD-L1 mRNA和蛋白的表達明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的PD-L1 mRNA和蛋白的表達明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 人參皂苷Rh2+Rg3對胃癌細胞MGC-803中PD-L1表達的影響Tab 1 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the expression of PD-L1 in gastric cancer cell

與對照組相比，*P<0.05vs. the control group, *P<0.05圖1 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803增殖能力的影響(n=9)Fig 1 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the proliferation capacity of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1 (n=9)

A.PD-L1 mRNA；B.PD-L1蛋白；與對照組相比，*P<0.05；與Rh2+Rg3組相比，#P<0.05A.PD-L1 mRNA；B.PD-L1 protein；vs. the control group, *P<0.05; vs. the Rh2+Rg3 group, #P<0.05圖2 人參皂苷Rh2+Rg3對胃癌細胞MGC-803中PD-L1表達的影響Fig 2 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the expression of PD-L1 in gastric cancer cell MGC-803

3.3 各組胃癌細胞MGC-803的凋亡情況

Rh2+Rg3組胃癌細胞MGC-803的凋亡率明顯高于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的細胞凋亡率明顯低于Rh2+Rg3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803凋亡的影響Tab 2 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the apoptosis of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

A.對照組；B.Rh2+Rg3組；C.Rh2+Rg3+PD-L1組A. control group; B. Rh2+Rg3 group; C. Rh2+Rg3+PD-L1 group圖3 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803凋亡的影響Fig 3 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the apoptosis of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

3.4 各組胃癌細胞MGC-803克隆形成情況

Rh2+Rg3組胃癌細胞MGC-803克隆數量明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的細胞克隆數量明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖4。

表3 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803克隆形成的影響Tab 3 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on clone formation of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

A.對照組；B.Rh2+Rg3組；C.Rh2+Rg3+PD-L1組A. control group; B. Rh2+Rg3 group; C. Rh2+Rg3+PD-L1 group圖4 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803克隆形成的影響Fig 4 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on clone formation of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

3.5 各組胃癌細胞MGC-803的遷移和侵襲情況

Rh2+Rg3組胃癌細胞MGC-803的遷移細胞數和侵襲細胞數明顯低于對照組，Rh2+Rg3+ PD-L1組的遷移細胞數和侵襲細胞數明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖5。

圖5 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803遷移和侵襲的影響Fig 5 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the migration and invasion of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

表4 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細胞MGC-803遷移和侵襲的影響Tab 4 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the migration and invasion of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting

4 討論

人參皂苷Rh2和Rg3是人參抗腫瘤的活性成分。相關研究結果表明，人參皂苷Rh2和Rg3可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞分化和腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，逆轉腫瘤細胞耐藥，抑制腫瘤血管的形成[8]。人參皂苷Rh2和Rg3已被闡明在腫瘤的發生中發揮著主要作用[9]。本研究結果發現，人參皂苷Rh2和Rg3抑制了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進了胃癌細胞凋亡，而大量PD-L1的加入則減弱了上述作用，表明人參皂苷Rh2和Rg3在胃癌中起抑癌作用，而PD-L1為腫瘤啟動因子。人參皂苷Rh2、Rg3和PD-L1相互作用的研究，為了解人參皂苷Rh2、Rg3和PD-L1在胃癌中的作用機制提供了新的視角。

人參皂苷Rg3屬于二醇皂苷，是人參中稀有的皂苷，具有抗炎、抗腫瘤、增強免疫能力和抑制血管生成等作用[10]。其與人參皂苷Rh2共同作用，可增強藥效。根據本研究結果，人參皂苷Rh2和Rg3可能是胃癌患者治療藥物的潛在候選。PD-L1在維持正常機體保護性免疫和免疫耐受的平衡中起著至關重要的作用，PD-L1的表達上調是通過細胞內多種信號傳導途徑進行調節的，在腫瘤微環境免疫效應發揮著調控作用。在腫瘤微環境中，PD-L1表達上調，從而激活程序性死亡蛋白-1(PD-1)/PD-L1通路，介導腫瘤的免疫逃逸。PD-1/PD-L1是免疫抑制效應的調控因子，在胃癌方面已得到應用[11]。本研究以人參皂苷Rh2和Rg3為研究對象，發現其能夠抑制胃癌MGC-803細胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表達。本研究通過PD-L1載體質粒轉染人參皂苷Rh2和Rg3處理的胃癌MGC-803細胞，發現PD-L1能夠促進胃癌MGC-803細胞的增殖、遷移和侵襲，促進克隆形成，抑制MGC-803細胞凋亡。本研究結果說明PD-L1是腫瘤的啟動因子，進一步證實了PD-L1對腫瘤具有促進作用。有研究結果表明，PD-L1抗體可以抑制免疫細胞和腫瘤細胞之間的相互作用，從而維護免疫細胞對腫瘤細胞的細胞毒性[12-13]。本研究中，人參皂苷Rh2和Rg3能夠明顯降低胃癌MGC-803細胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表達，即人參皂苷Rh2和Rg3能夠顯著抑制腫瘤的啟動因子，阻止腫瘤的發生和發展。相關研究結果表明，人參皂苷Rh2和Rg3能對喉鱗癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用[14-15]。雖然目前化療仍是主要手段，但化療對正常細胞也會造成一定的影響。而人參皂苷Rh2和Rg3屬于天然藥物，不僅具有較強的抗腫瘤活性，還能夠起到抗腫瘤信號通路的作用[16-17]。有研究結果認為，PD-L1與胃癌的發生有關，可能是胃癌患者臨床診斷、免疫治療和預后的有效靶點[18]。特別值得一提的是，PD-L1單克隆抗體的臨床試驗已經順利進行，并表現出良好的抗腫瘤活性[19-20]。本研究還證實了PD-L1的腫瘤促進作用。

綜上所述，人參皂苷Rh2和Rg3通過調節PD-L1的表達，抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。提示PD-L1可能是胃癌患者診斷、治療和預后的潛在靶點。