漢麻籽粕酶解物中抗肝癌Hep3B細胞活性肽的分離與鑒定

魏連會， 董 艷， 石 杰， 宋淑敏， 李國巍， 孫興榮

(黑龍江省科學院大慶分院1，大慶 163319)(黑龍江省農業科學院大慶分院2，大慶 163316)

漢麻(CannabissativaL)也稱為火麻、漢麻、線麻、黃麻等，是一種一年生草本植物，廣泛種植在中國和加拿大等地區[1]，是工業用途漢麻纖維、種子、油和粕的重要原料來源[2,3]。其中四氫大麻酚(Δ-9-tetrahydrocannabinol, THC)質量分數低于0.3%，為無毒品種。目前在世界各地幾十個國家已被批準種植和加工[4]，并已被用于開發系列漢麻產品，廣泛應用于化妝品、功能性食品和營養保健品行業[5]。漢麻籽的藥用功效在2000年版《藥典》和2001年“藥食同源”名單中均有記載[6]。漢麻籽中含有不飽和脂肪酸、蛋白質，以及所有人體必需氨基酸[7]。

漢麻籽蛋白經水解后產生的漢麻籽多肽具有多種健康功效和藥用價值。其生物活性已經被證實，如抑制血管緊張素轉換酶(ACE)[8]、抑制腎素[9]、抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)[10]、金屬結合能力[11]、抗氧化活性[12]、降膽固醇作用[13]和血糖調節作用[14]。

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，是世界范圍內發病和死亡的主要疾病之一[15，16]。目前，主要的肝癌化療藥物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑、紫草素等，這些藥物有嚴重的副作用且價格昂貴[17]。因此，尋找一個既便宜又高效且副作用小的化療藥物迫在眉睫。多肽，除了具有營養價值外，還有其他的生物活性，其中包括抗癌作用。相比傳統藥物、多肽具有高親和力、強特異性、低毒性和充足的組織滲透[18]。一些研究已經證明食源性蛋白質、多肽和氨基酸對癌細胞凋亡、血管生成具有調節作用，顯示出抗腫瘤的潛力，這些肽具有抗腫瘤、抗增殖、抗炎等作用[19]，這些肽的抗癌活性主要通過誘導腫瘤細胞自噬或凋亡，如玉米肽、綠豆肽和大豆肽等[20-24]。然而，漢麻籽多肽的抗癌作用及具有抗癌活性的多肽的結構鑒定鮮見報道。

多肽的結構決定著生物活性肽的生理功能，明確氨基酸的組成對揭示構效關系具有重要的意義[25，26]。因此，在本研究中，利用復合蛋白酶酶解漢麻籽粕，制備了漢麻籽蛋白水解物，通過超濾分離對漢麻籽多肽進行初步純化，測定漢麻籽多肽的抗肝癌Hep3B細胞作用，采用MALDI-TOF/TOF質譜鑒定多肽結構，最后通過合成漢麻籽多肽進一步驗證其抗肝癌活性，旨在為漢麻籽抗肝癌活性肽的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽粕水解物；木瓜蛋白酶(酶活力為 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為 1.3×105U/g)； Hep3B 細胞；人正常肝細胞L02。

1.2 儀器與設備

4800 Plus MALDI TOF/TOFTM分析儀，AB SCIEX質譜儀，pellicon 切向流過濾系統，FD-2A-80型真空冷凍干燥機，800TS酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 漢麻籽粕酶解物制備與多肽的分離純化

稱取一定質量漢麻籽粕，按照1∶5的比例加入蒸餾水溶解，加入5.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH為5.5，酶解溫度為75 ℃，酶解時間為3 h，95 ℃水浴滅酶15 min，10 000 r/min離心15 min，分離取漢麻籽粕上清液。將酶解得到的漢麻籽粕酶解液，通過切向流膜過濾系統，進行分離純化，采用的過濾膜截留分子質量為3 ku，收集分子質量小于3 ku漢麻籽多肽肽段，用真空冷凍干燥機凍干備用。

1.3.2 漢麻籽多肽抗肝癌Hep3B 細胞活性研究

1.3.2.1 細胞培養

將肝癌Hep3B肝癌細胞系和LO2正常肝細胞在含質量分數10%牛血清(FBS)和質量分數1%雙抗的DMEM培養液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.3.2.2 細胞活力研究

采用MTT比色法檢測細胞活力。將肝癌Hep3B細胞和正常LO2細胞接種于96孔板中，每孔體積為200 μL(細胞數約為每孔 4×104個/mL)，向每孔中加入不同質量濃度的漢麻籽多肽(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL)孵育24 h，向每孔滴加噻唑藍溶液(終質量濃度為 5 mg/mL)，放回培養箱內37 ℃、5% CO2繼續培養2 h， 然后取出上清液將孔內的培養液小心吸出，使用 PBS 輕輕的沖洗 1～3次。吸走 PBS后，每孔加入100 μL的 DMSO 溶劑，并放在搖床上慢速混勻 15 min。用酶標儀測量吸光度(A490)值，計算細胞存活率。

1.3.3 漢麻籽多肽組分的分子質量分布范圍測定

采用MALDI-TOF 基質輔助激光解析飛行時間質譜對漢麻籽粕酶解物的分子質量范圍進行測定[27]。

1.3.4 漢麻籽抗肝癌活性肽組分的氨基酸序列分析

采用 MALDI-TOF-TOF質譜重新進行肽段測序，具體操作如下：取1 μL漢麻籽多肽樣品點至樣品靶上，自然干燥后，再取1 μL CHCA基質溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點校準標準品干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點校準標準品(4 700蛋白質組學分析交叉校準混合物1)。

校準混合物1進行外標一級校準，分子質量誤差小于0.5 u；采集圖譜條件：一級質譜(MS)范圍：800～4 000m/z，每張譜圖累加500個激光光束；選擇供試品目標多肽對應母離子進行二級質譜測試(MS/MS)，每張譜圖累加2 500個激光光束，在主要參數固定的前提下，分別調整激光強度和碰撞室(CID)氣體氣壓來獲取最佳譜圖。

1.3.5 抗肝癌活性多肽的合成及功能驗證

以獲得的抗肝癌活性多肽為目標，委托上海某公司進行合成，共合成YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH 4種多肽，并對合成多肽的純度與一級結構進行分析。同時，測定不同濃度合成多肽對肝癌Hep3B細胞的抑制活性。

2 結果與分析

2.1 漢麻籽多肽抗肝癌活性的研究

如圖1所示，以不同質量濃度(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL) 漢麻籽多肽處理細胞24 h后，采用MTT法測定細胞活力。結果表明，在一定的濃度范圍內，漢麻籽多肽可有效抑制Hep3B肝癌細胞的增殖，降低細胞存活率，但不影響LO2正常肝細胞的生長，隨著漢麻籽多肽濃度的增加，漢麻籽多肽對肝癌Hep3B細胞的抑制作用逐漸增強，呈現出一定的量效關系。

圖1 漢麻籽多肽對Hep3B細胞存活率的影響

2.2 漢麻籽多肽的分子質量分布測定

為獲得漢麻籽生物功能肽，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解漢麻籽粕。采用MALDI-TOF/TOF質譜分析漢麻籽多肽超濾分離組分的分子質量，分布范圍如圖2所示。生物活性肽通常含有2～20個氨基酸并具有多種生物活性。由圖2可知，漢麻籽多肽的分子質量檢測結果表明，多肽的分子質量主要在200～1 500 ku范圍內，說明得到的漢麻籽多肽主要是由2～10個氨基酸殘基組成的小肽段。宋淑敏等[27]研究表明，寡肽尤其是二肽或三肽，較容易被人體有效吸收并經人體小腸黏膜利用。因此，漢麻籽多肽也可能被人體有效吸收，從而發揮其生物學作用。

圖2 漢麻籽多肽的分子質量分布

2.3 漢麻籽多肽的質譜鑒定結果

根據多肽組分的分子質量分布，采用MALDI-TOF-TOF質譜重新進行肽段的測序，對4個峰值較高的肽段進行序列分析，多肽序列分析結果及質譜如表1，共鑒定出4種多肽序列，分別是YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。

表1 漢麻籽多肽的氨基酸序列分析

2.4 多肽合成及活性測定

合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH的純度分別為98.90%、98.03%、99.90%、98.63%同時對合成多肽的抗肝癌Hep3B細胞活性進行測定，如圖3所示。結果表明，漢麻籽多肽YGRDEISVF和NKSGTYSNDDLSH具有很強的抗肝癌細胞增殖作用。

注：LO2-正常肝臟細胞；Hep3B為人肝癌細胞。a～d分別為合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。圖3 合成多肽對肝癌Hep3B 細胞的存活率的影響

3 結論

本實驗采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對漢麻籽粕進行酶解，利用超濾系統分離純化，得到分子質量小于3 ku 的小分子多肽。探究漢麻籽多肽的抗肝癌作用，實驗證明了漢麻籽多肽能夠抑制肝癌Hep3B 細胞的增殖，同時對正常的肝細胞無毒副作用。采用質譜分析漢麻籽多肽的分子質量分布范圍及其高峰值的序列特征，鑒定了4種小肽的氨基酸序列為YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。經固相合成，合成肽的分子質量分別為1 085.20、1 276.35、1 320.30、1 437.20 u，其純度分別為98.90%、98.03%、99.90%、98.63%。同時，合成多肽YGRDEISVF、NKSGTYSNDDLSH具有很強的抗肝癌細胞增殖作用。