DHA藻油納米乳液制備及穩定性的研究

張程超， 蔡伊娜， 彭池方， 王正武

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室1，無錫 214122)(江南大學食品學院2，無錫 214122)(深圳海關食品檢驗檢疫技術中心3，深圳 518045)(上海交通大學農業與生物學院4，上海 200240)

微藻油富含二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等ω-3 多不飽和脂肪酸。這些脂肪酸不僅對人體大腦發育、提高記憶力、預防心血管疾病以及抗炎等領域有很好的生理作用[1,2]，而且對嬰幼兒視網膜以及認知能力的形成非常重要[3]；這推動了微藻油產品已經廣泛應用于食品、保健品、醫藥和飼料行業中。由于DHA等ω-3 多不飽和脂肪酸分子中雙鍵數目較多，在加工、運輸和貯藏過程中容易氧化，尤其是因加熱造成的脂肪酸氧化生成氫過氧化物，然后會進一步氧化生成醛、酮、酸等小分子化合物，產生哈喇味，嚴重影響油脂品質[3,4]。采用乳化或微膠囊包埋微藻油是提高其應用穩定性的重要途徑[5]，目前國內外已有大量這方面的研究工作報道。例如，He等[6]用Surfactin作為表面活性劑制備藻油乳狀液的方法，并進行模擬消化實驗研究乳狀液對藻油的保護效果，為藻油乳狀液在食品中的實際應用打下基礎，但是該乳液體系的高溫穩定性尚未評估。袁博[7]采用復凝聚法對藻油進行包埋，冷凍干燥得到微膠囊產品。通過控制包埋體系的zeta-電位、濁度和微膠囊的形態優化了復凝聚過程，同時研究了藻油微膠囊的氧化穩定性，但是僅評價了最高60 ℃下的熱穩定性。

多層納米乳液是由多層(而非單層)界面層包含油滴的納米乳液。多層乳液可完全由食品級原料(如表面活性劑、蛋白質、多糖、磷脂)形成[8]，其加工操作是食品工業常見的單元操作(如均質與混合)。通過控制多層乳液納米層狀結構的組成和性質，可顯著提升納米乳滴在環境壓力下的穩定性[9]，如高酸堿、高鹽、加熱、凍融等。目前，采用雙層乳液包埋β-胡蘿卜素[10]、姜黃素[11]、葉黃素[12]、魚油[13]、橙皮苷[14]等物質的研究報道較多，但包埋藻油的研究較少。本研究選用阿拉伯膠和乳清分離蛋白通過層層自組裝實現了DHA藻油的包埋，并系統評估了所制備雙層納米乳液的穩定性；以期能夠得到在貯藏和加工過程，尤其在高溫下的高穩定性藻油產品，為藻油在更多種類食品體系中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(食品級)；阿拉伯膠(食品級)；DHA藻油；其他實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FJ-200高速分散均質機，JHG-54-P100高壓均質機，納米粒度與zeta電位儀，氣相色譜儀Agilent 7820A，流變儀DISCOVERY DHR-3。

1.3 實驗方法

1.3.1 DHA藻油單層納米乳液的制備

制備質量分數為0.5%～2.5%的WPI溶液，加入質量分數為0.02%的苯甲酸鈉作為防腐劑，在25 ℃下以1 000 r/min的轉速磁力攪拌30 min，加入質量分數1.5%的油相，使用高速剪切機以12 000r/min的轉速高速剪切3 min，得到粗乳液，再使用高壓均質機進行二次高壓均質，一級50 MPa，二級5 MPa，循環3次，形成由乳清分離蛋白包埋的DHA藻油單層納米乳液WPI-e。

1.3.2 DHA藻油雙層納米乳液的制備

制備質量分數1%～3%的GA溶液形成水相，將GA水相和藻油單層納米乳液的pH調節至4.0[15]，兩者按照一定的體積比混合，最后用高壓均質機進行2次高壓均質，一級50 MPa，二級5 MPa，形成內層為WPI外層為GA的雙層納米乳液WPI-e /GA。

1.3.3 納米乳液顆粒粒徑、粒徑分布指數以及Zeta電位的測定

使用納米粒度及ZETA電位儀測定藻油納米乳液的粒徑、粒徑分布指數及Zeta電位[16]，儀器參數設置為：固定角度90°，背散射光角度為173°，相對折射率為1.590，吸收率為0.001，在25 ℃的溫度下測試，每個樣品重復3次。

1.3.4 DHA藻油中不飽和脂肪酸的測定

油脂中不飽和脂肪酸含量測定參考國家標準GB 5009.168—2016[17]。

1.3.5 乳液的穩定性測試

1.3.5.1 乳液的熱穩定性

分別取10 mL不同的單、雙層藻油乳液加到試管中，然后對其進行避光恒溫加熱，溫度分別設定成40～90 ℃，在加熱1 h之后立即取樣，用水冷待其冷卻完畢，測定乳液的PDI、粒徑和Zeta電位，每個樣品重復3次。同時，在40、60、80、90 ℃處理之后測試每個樣品經過熱處理其DHA的含量。

分別取不同的單、雙層藻油乳液10 mL加入到密封好的耐高溫試管，分別設置油浴鍋的溫度120、150 ℃對其加熱20 min立即取出冷卻到室溫，測定乳液的PDI、粒徑和Zeta電位同時測試每個樣品熱處理之后的DHA含量。每個樣品重復3次。

1.3.5.2 乳液的凍融穩定性

分別取5 mL乳液加入到10 mL離心管中，并置于-20 ℃的溫度下冷凍0～12 h。冷凍完畢之后將離心管取出在37 ℃恒溫水浴鍋中解凍1 h，測定其PDI、粒徑和Zeta電位。每個樣品重復3次。

1.3.5.3 乳液對鹽的耐受性

使用0.1～0.5 mol/L的NaCl溶液分別將藻油乳液稀釋100倍，充氮氣在4 ℃冰箱中避光保存1 h之后取樣，立即測定乳液的粒徑、PDI、Zeta-電位。

1.3.5.4 乳液對酸堿的耐受性

取15 mL藻油乳液加入到50 mL離心管中，用1 mol/L的HCl或者1 mol/L的NaOH將乳液pH調整為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，充氮氣在4 ℃下保存1 h后立即取樣，測定其粒徑、PDI和電位。

1.3.4.5 乳液的貯藏穩定性

將樣品在常溫下封口保存7周后，每周取1次樣測定其粒徑，PDI和Zeta-電位。

2 結果與分析

2.1 納米乳液的制備

粒徑，粒徑分布和電位是乳液的重要表征手段，乳滴的粒徑越小，乳液的布朗運動越弱，從而越穩定；乳液的粒徑分布越均勻，其性質均一性越好[18]；液滴之間的靜電排斥作用力越大越不容易絮凝成大液滴，乳液的乳滴的Zeta電位絕對值一般大于20 mV時其穩定性較好[19]。

同時在制備納米乳液的過程中需要控制好乳化劑和油相的含量，才能制備出穩定的乳狀液。在預實驗中發現油相質量分數高于1.5%時，采用WPI蛋白乳化難以得到充分乳化的乳液，因此，本研究乳化體系設定油相質量分數為1.5%。并且，選用WPI蛋白和阿拉伯膠多糖作為制備雙層納米乳液時，初步實驗發現，WPI蛋白為內層多糖為外層可制備得到肉眼可見穩定的乳液，而采用多糖為內層WPI蛋白為外層乳化油相，難以得到穩定的納米乳液。因此，后續進一步對WPI蛋白為內層多糖為外層制備DHA藻油乳液時的條件開展了詳細分析。

2.1.1 不同WPI濃度對單層納米乳液的影響

由圖1可知，隨著乳清分離蛋白濃度的增加，DHA藻油單層納米乳液的粒徑和PDI隨著WPI的濃度升高而下降并在蛋白質質量分數達到1.5%后趨于穩定，此時粒徑為262 nm，PDI為0.182，在低蛋白濃度時，油脂不能被很好的包埋，有一部分油脂破乳之后聚集在一起粒徑增大，而增加乳化劑含量之后乳清分離蛋白顆粒緊密排列在藻油表面，更好地包封住油脂且不發生絮凝[20]，使粒徑降低。但是從圖1看出由于只用了蛋白作為單層乳化劑，液滴所帶電荷隨著其含量上升略有升高，但數值仍然較小低于20。Li等[21]用乳清分離蛋白制備百里香精油納米乳液時，得到了和本實驗相似的結果。

圖1 WPI濃度對單層乳液粒徑、PDI和Zeta-電位的影響

2.1.2 阿拉伯膠濃度和內外層乳化劑比例對雙層乳液的影響

將WPI質量分數為1.5%時制備的單層乳液進一步采用阿拉伯膠乳化，并控制多糖蛋白體積比為7∶3。如圖2所示，隨著GA質量分數升高，乳液的粒徑和PDI均逐漸降低，并在2.5%之后趨于穩定。當GA質量分數為1%時，乳液的粒徑為565 nm，顯著高于單層乳液的粒徑262 nm。這是由于GA為陰離子多糖，當其沒有完全包覆油滴外的WPI蛋白分子時，納米粒子之間會存在其與WPI分子暴露基團之間的靜電相互作用；較低的Zeta電位(-19.5 mV)也可證明這一點。當GA質量分數為2.5%時，乳液的粒徑為354 nm，其相對單層乳液粒徑的增加(93 nm)可主要歸因于GA分子在WPI分子外的堆積。此時Zeta電位也顯著增加(-25 mV)，也暗示GA分子已將包裹油滴的WPI蛋白分子充分包覆[22,23]。

圖2 不同阿拉伯膠濃度對雙層乳液粒徑、PDI和電位的影響

2.2 兩種乳液在不同條件下的穩定性比較

食品在企業生產或者日常使用中常常會經歷一些加工過程，比如高溫、鹽離子的添加、凍融、改變酸堿性等，而由于藻油DHA含有不飽和雙鍵，在這些條件下很容易氧化降解變質，因此各種藻油傳輸系統需要抵抗食品加工和貯藏帶來的壓力。為了方便比較，在做乳液穩定性評估時，兩種乳液體系的pH均為4.0。

2.2.1 兩種納米乳液室溫貯藏穩定性

將兩種乳液在常溫下貯藏7周后，測試了其粒徑、Zeta電位的變化、以及DHA保留率，以評估其理化穩定性。如圖3所示。隨著貯藏時間的延長，在常溫下儲藏7周后，雙層乳液的粒徑和PDI分別從354 nm和0.22緩慢增加至525 nm和0.67，而單層乳液的粒徑大幅增加到1 150 nm，PDI增加到0.98，增幅均顯著高于雙層乳液。雙層乳液的電位較高，并且基本保持不變，有利于納米顆粒的穩定，并減少絮凝；而單層納米乳液的電位較低，液滴之間的靜電排斥作用力較小，乳液中的納米粒子之間更容易慢慢靠近聚集形成更大顆粒，并誘導油脂破乳。隨著貯藏時間的延長，雙層納米乳液的DHA仍保留了81.44%，而單層納米乳液的DHA仍保留率下降至70.62%。這也證實了雙層乳化劑對藻油的氧化保護作用明顯高于單層乳化劑[24]。本實驗的結果與Tang等[25]的研究相一致。

圖3 儲藏時間對不同乳液理化性質的影響

2.2.2 乳液的熱穩定性

將兩種乳液在40～90 ℃下加熱1 h后，分析其變化。結果可見，隨著溫度的升高雙層乳液的乳滴粒徑和PDI未發生明顯變化，而單層納米乳液在70 ℃時粒徑已經達到了1 286 nm(圖4a)，且隨著溫度上升，其粒徑仍不斷增加。經90 ℃熱處理后，雙層乳液中DHA的質量分數相比較未被加熱處理過的樣品分別減少了39.2%和7.7%，在120 ℃和150 ℃加熱20 min之后，兩種乳液的粒徑都因為高溫而增加，DHA保留率分別為60.3%、56.4%和85.2%、81.8%(圖4b)。這是因為熱處理使得單層納米乳液中蛋白質的二級結構展開破壞了保護膜[26]，而雙層納米乳液中GA將WPI蛋白分膜充分包覆，且膜層較厚，因此能夠顯著削弱高溫的影響。

圖4 熱處理對不同乳液理化性質的影響

2.2.3 乳液的凍融穩定性

由圖5可知，隨著冷凍時間的延長，兩種乳液的粒徑和PDI均不斷增大。冷凍2 h以后，兩種乳液的粒徑已有顯著增加，分別達到557.3 nm和524.1 nm；但是單層乳液的粒徑已經大于雙層乳液。冷凍12 h之后，單層乳液的粒徑和PDI增加至1 461 nm和1，雙層納米乳液增長至1 116 nm和0.92。這可歸因于單層乳化劑形成的保護膜易被冷凍時產生的晶破壞，而由雙層乳化劑形成的保護膜更厚，因而更能抵抗冰晶的破壞[27]。

圖5 冷凍-解凍后不同乳液粒徑的變化

2.2.4 乳液對酸堿的耐受性

食品加工過程中通常會加入食品添加劑，這會改變體系的酸堿性，因此乳液對酸堿的耐受性也是其在食品體系中應用的重要考量因素。如圖6所示，在pH 2～8范圍內，單層乳液體系的粒徑pH=5時突然升高，粒徑躍升到1 546 nm，PDI為1；而雙層乳液的粒徑在pH值2.0到8.0范圍，一直保持穩定，除了pH=2時其粒徑躍升為818 nm。出現這一現象的原因主要是pH的變化改變了乳液體系的電位。由圖7b可知，單層乳液的電位在pH為5時絕對值接近0，此時接近乳清分離蛋白的等電點[28]。

圖6 pH對不同乳液粒徑和電位的影響

而雙層乳液在酸性條件下的粒徑增大是因為此時電位絕對值較低，靜電斥力不夠造成液滴聚集成大顆粒；此結果與Saman等[29]的研究結果一致。

2.2.5 鹽濃度對乳液穩定性的影響

液態食品體系中通常會存在一些鹽離子，可能對納米乳液的狀態產生影響。本研究選用不同濃度的NaCl添加到兩種納米乳液中，分析了其對乳液物理穩定性的影響。如圖7所示，隨著Na+濃度上升，單層乳液的粒徑增尤其明顯并開始出現分層現象，相比之下雙層乳液粒徑隨著金屬離子的濃度從0.1～0.5 mol/L，只增加了100 nm，PDI的變化也呈同樣的趨勢，出現這種現象的原因是金屬離子產生的靜電屏蔽效應[30]，由圖7b可知兩種乳液的電位絕對值都隨著離子濃度的上升而降低，帶正電的Na+會中和液滴表面帶的負電。而雙層乳液較厚的界面膜對靜電屏蔽作用的抵抗力會提高，所以雙層乳液能產生比單層乳液更好的鹽離子耐受性。

圖7 NaCl濃度對不同乳液粒徑和電位的影響

3 結論

本研究基于層層自組裝和高壓均質制備了一種藻油雙層納米乳液。其制備的最佳工藝參數為：高壓均質壓力50 MPa，均質次數3次，內層用乳清分離蛋白作為乳化劑，最佳質量分數1.5%，外層為阿拉伯膠最佳質量分數為2.5%，藻油質量分數為1.5%，此時的藻油納米乳液粒徑為354 nm，PDI為0.22，Zeta-電位為-25 mV。該納米乳液對熱、凍融、鹽和酸堿均顯示出具有較高的耐受性，且長期貯藏穩定較好。本研究可為DHA藻油高穩定性產品的開發及其在食品加工中的應用提供技術參考。