白藜蘆醇對實(shí)驗(yàn)性兔肺動(dòng)脈高壓相關(guān)炎癥因子表達(dá)的研究

官占江 黑炳昌 郝文波 姜云飛 孟憲國 王媛媛 于海濤 楊磊

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一大類以肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的肺血管疾病。前列環(huán)素是目前臨床應(yīng)用最主要的治療方法，通過降低肺血管阻力和肺動(dòng)脈平均壓，使得患者的生活質(zhì)量得到明顯改善，并延長患者的生存時(shí)間，但不能從根本上達(dá)到治愈PAH的目標(biāo)[1-2]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）一種生物性很強(qiáng)的非黃酮類多酚化合物，是自然界多種植物抵抗外來侵害時(shí)產(chǎn)生的一種植物。Res具有抗氧化、阻滯細(xì)胞周期等多種作用，在各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明其在肺循環(huán)中發(fā)揮抗增殖、抗氧化、抗炎和內(nèi)皮保護(hù)作用，并防止PAH的進(jìn)展[3-4]。然而目前對于PAH中白藜蘆醇干預(yù)后主要炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平的影響研究較少，本研究旨在通過研究白藜蘆醇干預(yù)后實(shí)驗(yàn)性兔PAH模型肺組織中主要炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平的差異，探討白藜蘆醇在PAH發(fā)病機(jī)制中的改善作用及臨床意義。為控制及治療這種肺血管破壞性疾病提供新的治療靶點(diǎn)和臨床策略。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購買90只健康的新西蘭兔[中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，合格證：SCXK（湘）2015-0003）]，雌雄各占一半，體質(zhì)量約1.5～2.0 kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

白藜蘆醇中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院研制并提供，純度為98.5%；前列腺環(huán)素膠囊購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：0504081。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、野百合堿（monocrotaline，MCT）購自美國Sigma公司，檢測試劑盒購自美國R&D公司。試藥濃度配置：白藜蘆醇高劑量為120 mg/kg，中劑量為60 mg/kg，低劑量為30 mg/kg；前列腺環(huán)素濃度為1 mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型復(fù)制和動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)采用MCT腹腔注射方式造兔PHA模型[5-6]，建模前，每日觀察動(dòng)物的行為活動(dòng)、食量、毛色及大小便變化，并每周稱量體質(zhì)量，待動(dòng)物的精神狀體均達(dá)標(biāo)后，隨機(jī)選取15只動(dòng)物作為對照組，標(biāo)記為A組，并皮下注射DMSO 30 mg/kg。剩余75只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，皮下注射MCT 30 mg/kg，復(fù)制PAH動(dòng)物模型，連續(xù)注射7 d后，將75只造模動(dòng)物隨機(jī)分5組，每組各15只，分別為模型組，標(biāo)記為B組；陽性藥物對照組，標(biāo)記為C組，高劑量組，標(biāo)記為D1組；中劑量組，標(biāo)記為D2組；低劑量組，標(biāo)記為D3組。

1.3.2 給藥 對動(dòng)物體質(zhì)量進(jìn)行稱量，按照動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算給藥劑量，將前列腺環(huán)素配成動(dòng)物模型濃度1 mg/mL的溶液，并以1 mg/（kg·d）喂飼C組動(dòng)物；將白藜蘆醇配置成高劑120 mg/kg，中劑量60 mg/kg，低劑量30 mg/kg，并以高劑量120 mg/（kg·d）、中劑量 60 mg/（kg·d）、低劑量 30 mg/（kg·d）分別喂飼D1、D2、D3組動(dòng)物，連續(xù)喂飼6周，實(shí)驗(yàn)全程無動(dòng)物死亡。

1.3.3 檢測TNF-α和IL-6的水平 自開始給藥起，每隔2周隨機(jī)抽取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒，分別對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液樣本中TNF-α和IL-6的含量進(jìn)行檢測。每份標(biāo)本雙空白對照，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔吸光度值，并計(jì)算血液樣本中TNF-α和IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎性因子水平等計(jì)量資料用（）表示，比較差異采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇血清TNF-α表達(dá)量比較

實(shí)驗(yàn)性兔肺動(dòng)脈高壓造模成功后，與A組相比，B組、C組、D1組、D2組和D3組在第2周、4周、6周的TNF-α表達(dá)量均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與B組相比，治療組C組和D1組、D2組和D3組均能夠顯著降低TNF-α水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D1組降低效果顯著優(yōu)于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但D2、D3組治療效果與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 靜息狀態(tài)下血清TNF-α表達(dá)水平比較（ng/L，）

表1 靜息狀態(tài)下血清TNF-α表達(dá)水平比較（ng/L，）

注：*表示P＜ 0.05，第 2 周同 A 組相比，B 組、C 組、D1 組、D2 組、D3 組比較t=8.66、4.34、2.22、4.844、5.853，P＜ 0.05，第4周同A組相比，B組、C組、D1組、D2組、D3組比較t=8.418、4.257、2.186、4.477、5.180，P＜0.05，第6周同A組相比，B 組、C 組、D1、D2 組、D3 組組比較t=8.113、4.240、2.449、4.812、4.963，P＜ 0.05；#表示P＜ 0.05，第 2 周同 B 組相比，C 組、D1、D2組、D3組組比較t=4.671、7.826、4.535、2.705，P＜0.05，第 4周同B組相比，C組、D1組、D2組、D3組比較t=4.609、6.847、4.424、3.058，P＜ 0.05；第 6 周同 B 組相比，C 組、D1 組、D2 組、D3 組比較t=4.275、6.470、3.845、3.106，P＜0.05；Δ表示P＜0.05，第2周同C組相比，D1組比較t=2.871，第4周同C組相比，D1組比較t=2.312，第6周同C組相比，D1 組比較t=2.167，P＜ 0.05。

組別 第2周 第4周 第6周A 組（n=15） 70.61±18.23 78.29±19.32 88.21±20.31 B 組（n=15） 136.48±23.15* 148.14±25.68* 161.33±28.39*C 組（n=15） 100.25±19.14*# 109.14±20.36*# 121.37±22.47*#D1 組（n=15） 83.29±12.53*#Δ 93.06±17.64*#Δ 105.31±17.85*#Δ D2 組（n=15） 102.37±17.68*# 110.72±20.34*# 125.57±22.17*#D3 組（n=15） 114.06±22.23*# 120.08±24.56*# 130.47±25.98*#

2.2 白藜蘆醇血清IL-6表達(dá)量比較

實(shí)驗(yàn)性兔肺動(dòng)脈高壓造模成功后，與A組相比，模型組B組、C組、D1組、D2組、D3組在第2周、4周、6周的IL-6表達(dá)量均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與B組相比，治療組C組、D1組、D2組、D3組均能夠顯著降低IL-6水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D1組降低效果顯著優(yōu)于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但D2組、D3組治療效果與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 靜息狀態(tài)下血清IL-6表達(dá)水平比較（ng/L，）

表2 靜息狀態(tài)下血清IL-6表達(dá)水平比較（ng/L，）

注：*表示P＜ 0.05，第 2 周同 A 組相比，B 組、C 組、D1 組、D2 組、D3 組比較t=9.470、4.376、2.336、4.228、4.965，P＜ 0.05，第4周同同A組相比，B組、C組、D1組、D2組、D3組比較t=9.533、3.937、2.168、4.205、5.837，P＜0.05，第6周同A組相比，B組、C組、D1組比較t=8.867、5.004、3.316、5.177、5.276，P＜0.05；#表示P＜0.05，第2周同B組相比，C組、D1組、D2組、D3 組比較t=5.432、7.858、4.699、2.915，P＜ 0.05，第 4 周同 B 組相比，C 組、D1 組、D2 組、D3 組比較t=4.642、7.992、4.830、3.071，P＜ 0.05；第 6 周同 B 組相比，C 組、D1 組、D2 組、D3 組比較t=3.943、6.240、4.613、2.923，P＜ 0.05；Δ 表示P＜ 0.05，第2周同C組相比，D1組比較t=2.36，第4周同C組相比，D1組比較t=2.38，第6周同C組相比，D1組比較t=2.15，P＜0.05。

組別 第2周 第4周 第6周A 組（n=15） 65.26±13.45 71.32±12.48 75.63±14.07 B 組（n=15） 123.06±19.44* 132.17±21.34* 145.03±26.85*C 組（n=15） 88.32±15.35*# 96.22±21.08*# 109.57±22.18*#D1 組（n=15） 76.29±12.39*#Δ 81.19±12.45*#Δ 94.22±16.54*#Δ D2 組（n=15） 90.37±18.66*# 96.28±19.31*# 106.39±18.21*#D3 組（n=15） 100.06±23.58*# 108.34±21.16*# 116.54±26.53*#

3 討論

PAH實(shí)質(zhì)為一種破壞性疾病，其特征是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，ECS）過度增殖和血管阻塞，導(dǎo)致肺血管阻力持續(xù)增加，血管重塑，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓右心室肥厚與衰竭，生存期有限，與潛在病因無關(guān)，具有極高的發(fā)病率和死亡率[7-8]。PAH發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種機(jī)制，肺內(nèi)皮功能障礙、持續(xù)性血管收縮、慢性肺部炎癥和免疫功能紊亂，肺動(dòng)脈壁內(nèi)的各種血管細(xì)胞（肺內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞，以及肺血管細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞之間的協(xié)同作用，以及各種關(guān)鍵生長因子、激素、趨化因子和細(xì)胞因子對信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的過度激活。早期對肺動(dòng)脈高壓的治療主要局限于改善癥狀，而沒有對PAH針對性較強(qiáng)的有效藥物，如鈣通道阻滯藥、抗凝血藥等，雖然能短期改善血管環(huán)境，延緩患者病情，但是療效有限，不能達(dá)到治愈PAH的目標(biāo)。有研究[9]表明，細(xì)胞增殖引起血管閉塞是PAH最重要的特征，由于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致不可逆肺血管重構(gòu)，血管閉塞的低氧環(huán)境下炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子浸潤重構(gòu)肺動(dòng)脈周圍，進(jìn)而加劇肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞增殖加劇，最終促使心臟衰竭，這也是PAH導(dǎo)致患者死亡的重要原因，因此，對PAH治療的重點(diǎn)由擴(kuò)張血管藥物轉(zhuǎn)向逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)轉(zhuǎn)變。然而，新的藥理學(xué)提出，PAH許多細(xì)胞因子在PAH的形成中有著緊密的聯(lián)系，TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子能增加肺血管的反應(yīng)性，減少肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞前列腺素的合成，誘導(dǎo)肺血管收縮[10-12]，新藥物干預(yù)要著眼于對抗各種促增殖因子或抑制平滑肌細(xì)胞炎癥因子的滲出，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，阻抑炎癥細(xì)胞因子的作用，改善肺動(dòng)脈微環(huán)境是治療PAH新的方向[4]。最近研究[13-14]顯示，IL-6可能是PAH和低氧性PAH發(fā)病機(jī)制中最重要的細(xì)胞因子之一。臨床資料顯示，與正常患者相比，PAH患者血清IL-6水平明顯升高，促進(jìn)平均肺動(dòng)脈壓升高和終末肺小動(dòng)脈的肌化、增生，在PAH患者中TNF-α炎性細(xì)胞因子水平也明顯升高，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中TNF-α的過度表達(dá)可導(dǎo)致慢性肺部炎癥、間隔破壞、細(xì)支氣管炎和PAH，當(dāng)TNF-α以高水平表達(dá)時(shí)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧而損傷血管內(nèi)皮，且可一定程度上抑制血管舒張前列環(huán)素2的mRNA表達(dá)，進(jìn)一步加強(qiáng)肺血管收縮導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清中的TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組，這表明TNF-α、IL-6在PAH形成中有緊密的聯(lián)系，高劑量的Res干預(yù)后能顯著降低模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的炎性因子的水平，這也在一定程度上說明，Res可以通過抑制炎癥因子，減輕及緩解PAH癥狀。陽性對照藥物前列腺環(huán)素是治療PAH首選藥物，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，高劑量的Res降低炎癥在因子水平要高于前列腺環(huán)素，而中、低劑量的Res降低炎癥因子水平不及前列腺環(huán)素的治療效果。

綜上所述，白藜蘆醇能顯著抑制炎癥因子，并通過抑制炎癥因子降低細(xì)胞損傷，進(jìn)而改善PAH癥狀。但是由于PAH作用機(jī)制較為復(fù)雜，早期癥狀不明顯，Res對PAH的治療效果是否更優(yōu)于前列環(huán)素有待進(jìn)一步研究。