刺梨氣泡水配方優化及其抗氧化和抗疲勞活性研究

韋會平，馬禮平，肖明鵬

（1.攀枝花學院，四川 攀枝花 617000；2.貴州初好農業科技開發有限公司，貴州 六盤水 553000）

刺梨又名山王果、茨梨、木梨子，別名刺菠蘿、送春歸、九頭鳥等，為薔薇科薔薇屬多年生落葉小灌木刺梨（Rosa roxburghii Tratt）的果實，在我國貴州、四川、重慶、云南、鄂西、湘西等南方山區均有野生資源[1]。刺梨產業是貴州省重點發展的扶貧產業和生態產業。截至2020 年底，貴州省刺梨種植面積已達20 萬hm2以上[2]。此外，在四川冕寧、重慶秀山等地也有小規模種植。我國將刺梨作為藥食兩用食材已有悠久的歷史，在醫學典籍中也多有收載[3-4]。現代醫學研究表明，刺梨含有VC、黃酮、多酚、皂甙、多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等多種生物活性成分[4-8]，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫、促進消化和解痙、降血脂、降血糖、解酒保肝、抗動脈粥樣硬化等多方面藥理作用[4,9-13]。考慮到刺梨汁酸澀感很重，含量稍高會嚴重影響產品口感，因此目前市場上的刺梨果汁氣泡飲料產品一般將刺梨汁含量控制在5%以下。

本文將刺梨自身的藥理作用與牛磺酸、瓜拉納提取物（主要活性成分為咖啡因）等具有抗疲勞活性的食用添加劑有機結合，將刺梨獨具特色的酸澀感與碳酸飲料的清涼爽口特性相融合，研制具有獨特風味和更強抗氧化、抗疲勞活性的高果汁含量的新型氣泡飲料產品，為刺梨產業提供新的發展思路和產品支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

刺梨濃縮汁（鮮果壓榨、膜過濾的3 倍濃縮清汁，可溶性固形物含量為26.6 g/100 mL，VC 含量為4 600 mg/100 mL），貴州初好農業科技開發有限公司；L（+）-抗壞血酸標準品（純度≥99%），國藥集團化學試劑有限公司；果葡糖漿（F55），廣州雙橋股份有限公司；瓜拉納提取物（咖啡因20%），河南晟發生物科技有限公司。其他為常規試劑，配方產品用的為食品級，測定分析用的為分析純。測定用水為去離子水。

試驗動物：6～8 周齡SPF 級昆明系雄性小鼠，由長沙天勤生物技術有限公司提供（試驗動物許可證號:SCXK（湘）2014-0011），體重18～22 g。飼養溫度（22±3）℃，相對濕度60%±10%，室內噪聲＜55 dB，光照時間為每日7：00—18：00，飼喂普通飼料，自由采食和飲水。

1.1.2 儀器與設備

BS250S 型賽多利斯精密天平, 北京賽多利斯天平有限公司；PHSJ-6L 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；GR50 型全自動折光儀，上海卓光儀器科技有限公司；S500 型數顯式電熱恒溫水溫箱，南京曉曉儀器設備有限公司；800D 型高速離心機，江蘇金怡儀器科技有限公司；80-138 型全自動碳酸飲料殺菌灌裝機，上海沃迪智能裝備股份有限公司；PLC型碳酸飲料自動混比機，廣州達意隆包裝機械有限公司；UV1900 型紫外分光光度計，讓奇（上海）儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基本配方及工藝

產品配方由果葡糖漿、刺梨濃縮汁、二氧化碳、牛磺酸、瓜拉納提取物、檸檬酸、植酸鈉、三氯蔗糖8 種組分構成。根據一般藥用劑量，結合我國食品添加劑使用限量規定、產品質量和經濟性設計要求，將產品的核心功能性成分刺梨濃縮汁、牛磺酸、瓜拉納提取物和植酸鈉含量分別固定為7%、0.05%、0.05%和0.005%。其余組分主要用于調整產品感官品質，根據前期單因素試驗結果，確定其較為適宜的用量范圍為：果葡糖漿4%～10%,檸檬酸0.006%～0.012%，三氯蔗糖0.000 7%～0.001 3%，二氧化碳0.4%～1%。因此，配方只需對后4 種組分的用量進行優化即可。產品制作工藝為：先將配方中除二氧化碳以外的各組分用飲用水溶解混合均勻，定容，超高溫瞬時滅菌（132 ℃，5 s）并冷卻至40 ℃以下，再用碳酸飲料自動混比機充入二氧化碳，灌裝密封，即得到產品。

1.2.2 正交試驗設計

以果葡糖漿（A）、檸檬酸（B）、三氯蔗糖（C）和二氧化碳（D）為主要影響因素，以產品感官品質為考察指標，進行L16(45)正交試驗[14]，試驗因素與水平見表1。

表1 L16(45)正交試驗因素水平表Table 1 L16(45)orthogonal test factors and levels 單位：%

1.2.3 感官評價

參考復合運動飲料的感官評價方法[15]，結合本產品的實際特性，確定其感官評價標準（見表2）。邀請5位在飲料感官評價方面有較豐富經驗的人員組成感官評定小組，根據產品色澤、滋味、氣味、組織形態和氣泡5 個方面對產品進行綜合評價。

表2 產品感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of products

1.2.4 測定項目與方法

1.2.4.1 pH

使用pH 計檢測最終產品的pH。

1.2.4.2 離心沉淀率稱取一定質量（m0）的飲料置于離心管中，以3 000 r/min 離心10 min 后，對管內上清液稱重（m），按下式計算飲料的離心沉淀率[16]。

1.2.4.3 可溶性固形物含量

參照GB 15266—2009[17]中的折光計法進行測定。

1.2.4.4 VC 含量

參照GB 5009.86—2016[18]中的第3 法進行測定。

1.2.4.5 微生物指標

按GB 7101—2015[19]中的方法檢測產品的微生物菌落總數、大腸桿菌和致病菌等微生物指標。

1.2.5 體外抗氧化活性評價

1.2.5.1 羥基自由基清除率

參照文獻[20]中的方法并作適當修改。在試管中裝入2.0 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵和2.0 mL 9 mmol/L 水楊酸醇溶液，再準確加入2.0 mL 優化后的配方飲料樣品，搖勻繼續加入2.0 mL 20 mmol/L 雙氧水，混合搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，以純水作空白對照，2.9 g/L VC 作陽性對照，在510 nm 處測定吸光度值，平行測定3 次，按下式計算羥自由基清除率。

式中：A1為待測管吸光度值；A2為以水替代雙氧水的待測管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測管吸光度值。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除率

參照文獻[20]中的方法并作適當修改。將2.0 mL Tris-HCl 溶液（0.1 mmol/L，pH 8.2）裝入試管內，準確加入0.1 mL 優化后的配方飲料樣品和0.1 mL 3 mol/L的鄰苯三酚鹽酸溶液，于25 ℃下水浴加熱5 min，冷卻至室溫，以水作空白對照，2.9 g/L VC 作陽性對照，于420 nm 處測定吸光度值，仍按“1.2.5.1”中公式計算超氧陰離子自由基清除率。式中A1為待測管吸光度值；A2為以水替代鄰苯三酚鹽酸溶液的待測管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測管吸光度值。

1.2.6 抗疲勞活性測定[21]

1.2.6.1 小鼠分組與給藥

小鼠正常條件下自由攝食飲水,適應7 d 后，隨機分為4 組（n=10）：優化配方試驗組（L 組，用優化配方制作產品灌胃）；刺梨汁試驗組（M 組，按優化配方但不添加牛磺酸和瓜拉納提取物制作產品灌胃）；牛磺酸-瓜拉納提取物試驗組（N 組，按優化后配方但不添加刺梨濃縮汁制作產品灌胃）；空白對照組（CK 組，生理鹽水灌胃）。各組均按0.2 mL/10 g 體重劑量灌胃給藥，每日1 次，連續給藥7 d。

1.2.6.2 小鼠負重游泳試驗

它們是幾個月前弗里蒙特在油菜旁種植的野豌豆和苜蓿，這是兩種生長迅速的豆科植物，可防止油菜田里長出雜草，還可防止饑餓的甲蟲和象鼻蟲的攻擊，并讓弗里蒙特需要噴灑的除草劑和殺蟲劑減少一半。他說，種植單一植物的田里間種其他各類植物產生的效果“十分理想”。

最后一次灌胃給藥30 min 后，在水深30~40 cm、水溫20.0~25.0 ℃的游泳裝置中進行負重游泳試驗。每組取10 只小鼠，尾根部負重5%體重的鉛絲，置于游泳裝置中，記錄小鼠開始游泳至頭沒入水面下10 s不能上浮所用的時間，以此作為小鼠負重游泳時間。

1.2.7 數據處理

采用SPSS 25.0 對正交試驗結果進行分析和優化（Duncan 法），并對抗氧化和小鼠負重游泳試驗結果進行差異顯著性分析[15]。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。由表3 可見，因素A 除第2、4 水平間不存在顯著差異外，其余各不同水平間差異顯著（P＜0.05），以3 水平評分最高。從試驗實際觀察結果來看，果葡糖漿用量太少，會使產品甜度降低、酸澀感加重；用量太高，會使口感變得滋膩，并掩蓋刺梨的特殊香味和碳酸飲料的清涼感。綜合來看，應以3 水平為最佳。因素B 第1、2 水平與3、4 水平間差異顯著（P＜0.05），以1 水平評分最高。從試驗實際觀察結果來看，隨著檸檬酸用量增加，飲料會產生更重的酸澀感。但如果不添加檸檬酸，飲料顏色就不穩定。1 水平和2 水平之間沒有顯著差異，從節約成本考慮，以1 水平為最佳。因素C雖為影響產品品質的次要因素，但不同水平間差異仍達顯著水平，以2 水平評分最高。從試驗實際觀察結果來看，三氯蔗糖用量減少，則飲料酸澀感變重；用量過高，則其甜味會在口腔中產生嚴重的后味。2、3 和4水平之間無顯著差異，從節約成本考慮，以2 水平為最佳。因素D 不同水平間差異顯著，以1 水平評分最高。從試驗實際觀察結果來看，二氧化碳用量越高，飲料開蓋后的沖瓶現象就越嚴重，使消費者產生不安全感。1 水平和2 水平之間沒有顯著差異，從節約成本考慮，以1 水平為最佳。綜上所述，各因素對試驗結果影響的主次順序為A＞D＞B＞C，最佳組合為A3B1C2D1, 即果葡糖漿8%、檸檬酸0.006%、三氯蔗糖0.000 9%、二氧化碳0.4%。按篩選出的最佳組合，重復進行3 次驗證試驗，平均得分為86.6 分，高于正交試驗中各組合。

表3 正交試驗結果（n=7,±s）Table 3 Results of orthogonal test（n=7,±s）

表3 正交試驗結果（n=7,±s）Table 3 Results of orthogonal test（n=7,±s）

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

試驗號 因素 評分/分A B C D 空列63.0±3.2 2 1 2 2 2 2 64.5±2.2 1 1 1 1 1 1 3 39.8±1.9 4 1 4 4 4 4 32.1±2.2 1 3 3 3 3 5 67.8±3.6 6 2 2 1 4 3 55.5±4.2 2 1 2 3 4 7 70.0±3.4 8 2 4 3 2 1 60.9±3.6 2 3 4 1 2 71.9±5.6 10 3 2 4 3 1 69.7±3.6 11 3 3 1 2 4 65.3±4.2 12 3 4 2 1 3 77.6±5.4 13 4 1 4 2 3 70.7±4.6 14 4 2 3 1 4 70.9±3.8 15 4 3 2 4 1 45.9±3.2 16 4 4 1 3 2 42.6±2.9 k1 49.850 c 68.350 a 56.600 b 70.375 a 59.875 k2 63.550 b 65.150 a 63.950 a 65.350 a 62.250 k3 71.125 a 55.250 b 60.875 ab 54.975 b 60.900 k4 57.525 b 53.300 b 57.525 ab 53.300 b 59.025 R 21.275 15.050 7.350 17.075 3.225因素主次 A＞D＞B＞C優水平 A3 B1 C2 D1優組合 A3B1C2D1 9 3 1 3 4 2

表4 正交試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of orthogonal test

由表4 可見，總體試驗模型達極顯著水平（P＜0.01），因素A 和D 對試驗結果的影響達極顯著水平（P＜0.01），因素B 對試驗結果影響達顯著水平（P＜0.05）。根據F 值和R 值判斷，各因素對試驗結果影響的主次順序為A＞D＞B＞C。

2.2 產品質量檢驗結果

根據優化后的最佳配方制得的刺梨氣泡水產品色澤均勻而穩定、淡黃透亮，酸甜適中，并有刺梨的香味和氣泡飲料的清涼感，靜置后未有明顯沉淀與分層。產品的pH 為3.6，可溶性固形物含量8.3%，VC含量290 mg/100 mL,離心沉淀率0.34%，微生物菌落總數＜10 CFU/mL，大腸桿菌和其他致病菌未檢出。將產品分別在5、25、37 ℃（空氣相對濕度均為65%）下進行加速試驗，4 個月內3 組產品的外觀、口感、VC含量和微生物指標均未發生顯著改變。據此推斷，產品保質期可達1 年以上，達到運動飲料、碳酸飲料和果汁飲料相關質量標準[17,22-23]。

2.3 體外抗氧化活性結果與分析

體外自由基清除率測定結果見表5。優化配方試驗組和含等劑量（290 mg/100 mL）VC 對照組對羥自由基和超氧陰離子自由基都有較強的清除作用，但二者清除率存在極顯著差異（P＜0.01）。

表5 產品對自由基的清除率（n=3,±s）Table 5 Free radical scavenging rate（n=3,±s）單位：%

表5 產品對自由基的清除率（n=3,±s）Table 5 Free radical scavenging rate（n=3,±s）單位：%

注：同一列中不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），下表同。

組別 羥自由基 超氧陰離子自由基優化配方試驗組 92.62±1.24 A 82.84±1.46 A 290 mg/100 mL VC 對照組72.63±2.12 B 58.32±1.82 B

2.4 抗疲勞活性研究結果與分析

表6 小鼠負重游泳試驗結果（n=10,±s）Table 6 Results of weight-bearing swimming test in mice（n=10,±s）

表6 小鼠負重游泳試驗結果（n=10,±s）Table 6 Results of weight-bearing swimming test in mice（n=10,±s）

組別 數量 平均游泳時間/s CK 10 15.86±2.64 C L 10 26.25±1.86 A M 10 17.65±2.12 B N 10 18.42±1.65 B

3 結論與討論

本研究通過正交試驗確定刺梨氣泡水的最佳配方為：果葡糖漿8%,刺梨濃縮汁7%，二氧化碳0.4%,牛磺酸0.05%，瓜拉納提取物0.05%，檸檬酸0.006%，植酸鈉0.005%，三氯蔗糖0.000 9%。本配方中使用的刺梨3 倍濃縮汁，如果折合成原汁來計算，則產品中的果汁含量達到21%。根據配方工藝制得的產品中VC 含量達290 mg/100 mL, 相關指標均達到運動飲料、碳酸飲料和果汁飲料質量標準要求。產品對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用超過等劑量VC。小鼠負重游泳試驗結果表明，本產品具有較強的抗疲勞活性，而且將刺梨汁和牛磺酸、瓜拉納提取物搭配使用，其抗疲勞活性會極顯著增強。

產品配方中的刺梨濃縮汁除含較高的VC 以外，還含有VP、超氧化物歧化酶（SOD）、黃酮、多酚等多種抗氧化活性成分[2-4]。此外，配方中加入的植酸鈉、牛磺酸等也具有一定抗氧化作用[24]。本產品多種抗氧化活性成分協同作用，不僅獲得了比等劑量VC 更高的抗氧化活性，還獲得了良好的產品穩定性。有研究表明，人體在長時間劇烈運動時，體內的氧化還原平衡被破壞，生成過量的自由基與活性氧，促使體內發生氧化應激，出現組織損傷、肌肉收縮能力下降等不良現象，產生疲勞感，而對機體補充外源性抗氧化劑是延緩疲勞的有效方法之一[25-27]。因此，本產品有可能正是通過多種抗氧化活性成分協同作用機制，獲得了滿意的抗疲勞效果。