脊髓損傷小鼠中甘草苷通過抑制MAPK通路抑制炎癥和神經元凋亡

邵楊，安丹薔，楊楊，戴奇，姜曼玉，孫永新，徐愛華

（1.中國醫科大學附屬第一醫院康復醫學科，沈陽 110001；2.北京市紅十字會和平骨科醫院康復醫學科，北京 100161）

脊髓損傷非常常見且預后不良，據報道創傷性脊髓損傷的患病率為236/100萬～4 187/100萬［1］。脊髓損傷輕者喪失勞動力，重者肢體癱瘓，大小便失禁，喪失日常生活自理能力，嚴重影響患者的生活質量［2］。研究［3］揭示，脊髓損傷的病理生理機制主要分為兩大連續階段，第一階段包括最初的機械損傷，隨之繼發的缺血缺氧損傷、電解質紊亂、神經遞質蓄積、細胞壞死和凋亡、神經炎癥等一系列級聯瀑布反應為脊髓損傷的第二階段。然而，目前尚無有效的治療策略控制脊髓損傷的進展。因此，有必要尋找和開發新的治療方法和藥物，以減輕脊髓損傷。

甘草苷是從傳統中藥甘草中提取的一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性和潛在的應用前景，如預防炎癥、緩解疼痛、營養神經和保護神經等［4］。先前的研究［5］報道，甘草苷對大腦中動脈閉塞所致的局灶性腦缺血再灌注有神經保護作用。近期研究［4］發現，甘草苷對小鼠坐骨神經慢性縮窄性損傷導致的神經性疼痛有保護作用，并且這種作用可能與甘草苷對受損神經的直接保護作用和在脊髓水平的抗炎作用有關。然而，甘草苷對脊髓損傷的神經保護作用尚未見報道。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族包括胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），是一組在調控促炎性細胞因子表達中起重要作用的信號分子［3］。ERK/p38 MAPK/JNK信號通路在調節炎癥、氧化應激和細胞凋亡方面發揮重要作用［6］，該信號通路的激活有助于脊髓損傷后炎癥驅動的神經組織學破壞和神經元凋亡，從而加重脊髓損傷進展［6-7］。研究［8］發現，甘草苷可通過抑制MAPK信號通路，對心肌纖維化發揮保護作用。然而，甘草苷能否通過抑制MAPK信號通路抑制脊髓損傷后炎癥反應和神經元凋亡仍不清楚。因此，本研究探討了甘草苷對脊髓損傷的保護作用，及其與炎癥反應和神經元凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：48只雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自遼寧長生生物科技有限公司。小鼠于空調動物房飼養，動物房內環境溫度為（22±1）℃，相對濕度為45%～55%，光照時間為12 h/12 h明暗交替。實驗期間小鼠自由進食飲水。所有實驗均經中國醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：甘草苷（美國MCE公司）；全蛋白提取試劑盒、JNK抗體、p-JNK抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、內參抗體β-actin（沈陽萬類生物科技有限公司）；NeuN抗體、caspase 3抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Cy3標記山羊抗兔IgG（美國英杰生命技術有限公司）；FITC標記山羊抗小鼠IgG（英國Abcam公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精（北京索萊寶科技有限公司）；曙紅Y［生工生物工程（上海）股份有限公司］；In Situ Cell Death Detection Kit（紅光）（瑞士羅氏公司）；甲酚紫（中國國藥集團）。

1.1.3 主要儀器：紫外可見分光光度計（UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司）；電泳儀（DYY-7C，北京市六一儀器廠）；顯微鏡（BX53，日本OLYMPUS公司）；石蠟切片機（RM2235，德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷小鼠模型的建立［9］：將小鼠適應性飼喂1周后，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，隨后以T10椎板為中心，切開皮膚，鈍性剝離椎旁肌肉，暴露T9～11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，采用重3 g、直徑1.5 mm的撞擊器，從2.5 cm高度對暴露的脊髓進行撞擊，以產生中度挫傷性損傷。損傷部位存在挫傷、雙下肢抽搐和尾巴痙攣性搖擺為造模成功的標志。Sham組只進行T10椎板切除術，不撞擊。術后立即腹腔注射0.5 mL生理鹽水（100 μL/20 g）和丁丙諾啡（50 μg·kg-1·d-1），之后1次/d，持續4 d。進行膀胱按摩，2次/d，以防止泌尿系統感染，直到自主排尿。

1.2.2 實驗分組：將48只C57BL/6小鼠隨機分為4組，分別為假手術組（Sham組）、脊髓損傷模型組（SCI組）、低劑量甘草苷組（LQ-L組）、高劑量甘草苷組（LQ-H組），每組12只。建模后第2天，分別給予LQ-L組和LQ-H組小鼠低劑量（30 mg/kg）和高劑量（60 mg/kg）甘草苷灌胃給藥，Sham組和SCI組給予與LQ-H組同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續7 d。

1.2.3 運動功能的評估：每組隨機取6只小鼠，于術前和術后1、3、7、14、21 d進行小鼠后肢運動功能評分（Basso Mouse Scale，BMS）。觀察小鼠后肢踝關節活動度、協調性、腳爪姿態、軀干穩定性和尾巴姿態。BMS評分為0～9分，評分越低，運動功能障礙越重。由3名獨立評估者采用雙盲法進行評分，每次觀察小鼠4 min，取3名評估者評分的平均值作為最終得分。

1.2.4 HE染色：給藥完成后每組隨機取3只小鼠，腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死，以損傷點為中心，取縱向離損傷點5 mm以內的脊髓組織，用4%多聚甲醛固定24 h，包埋切片（切片厚度為5 μm），取縱向距離損傷中心2 mm處的脊髓切片，脫蠟至水后進行HE染色，脫水封片后于40倍鏡下觀察脊髓組織病變面積，相對病變面積（%）=炎癥面積/脊髓面積×100。

1.2.5 比色法測定MPO活性：給藥完成后每組隨機取3只小鼠，腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死，以損傷點為中心，取縱向離損傷點5 mm以內的脊髓組織，準確稱取組織質量，按照試劑盒說明書方法操作，將樣品制備成5%的組織勻漿，取制備好的組織勻漿按照說明書依次加入試劑后混勻，60 ℃水浴10 min，取出后立即在波長460 nm處測定各孔吸光度值，計算MPO活性，以間接評估中性粒細胞浸潤情況。MPO活性（U/g組織濕質量）=（測定OD值-對照OD值）/（11.3×取樣量）。

1.2.6 TUNEL染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后利用TUNEL反應液染色，DAPI染核后利用熒光猝滅劑封片，于400倍鏡下觀察脊髓組織中細胞凋亡情況。

1.2.7 免疫熒光染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后利用NeuN和caspase 3（稀釋比例1 ∶100）4 ℃孵育過夜，按照1 ∶200稀釋比例于室溫孵育二抗90 min，滴加DAPI復染核，熒光猝滅劑封片后于400倍鏡下觀察脊髓組織中NeuN、caspase 3的共定位，分析caspase 3陽性細胞數量。

1.2.8 Nissl染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后進行甲酚紫染色，冰醋酸乙醇分化、脫水封片后，于400倍鏡下觀察脊髓組織中神經元丟失情況。

1.2.9 Western blotting：取上述未經固定的3只小鼠的脊髓組織，利用全蛋白提取試劑盒抽提組織總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，按照40 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉進行封閉，4 ℃過夜孵育一抗（JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK、β-actin抗體按照1 ∶500稀釋），按照1 ∶5 000稀釋比例于37 ℃、45 min孵育二抗。ECL底物發光后，掃描膠片，采用凝膠圖像處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 甘草苷對脊髓損傷小鼠運動功能的影響

術后第1、3、7、14、21天，與Sham組比較，SCI組和LQ-L組的BMS評分均明顯下降（P<0.01或0.05）。術后第1天，與Sham組比較，LQ-H組BMS評分明顯下降（P<0.01），而術后第3、7、14、21天，2組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第14、21天，與SCI組比較，LQ-H組BMS評分明顯升高（P<0.05），而術后第1、3、7天，2組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第1、3、7、14、21天，SCI組、LQ-H組與LQ-L組比較，BMS評分的差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 4組BMS評分的比較Tab.1 Comparison of the BMS scores among the four groups

2.2 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織病變面積的影響

HE染色結果顯示：Sham組、SCI組、LQ-L組、LQ-H組脊髓組織相對病變面積分別為（0.00±0.00）%、（49.10±14.65）%、（31.30±8.24）%、（12.52±3.44）%。與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組相對病變面積明顯增加（P<0.01）；LQ-L組、LQ-H組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，相對病變面積明顯減小（P<0.05或0.01）。見圖1。

圖1 脊髓組織HE染色結果 ×40Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of the spinal cord tissues ×40

2.3 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中中性粒細胞浸潤的影響

將MPO活性作為中性粒細胞浸潤的間接測量指標，確定脊髓損傷后的炎癥狀況。與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組MPO活性明顯增加（P<0.05或0.01）；SCI組與LQ-L組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；LQ-H組與SCI組、LQ-L組比較，MPO活性明顯下調（P<0.05或0.01）。見圖2。

圖2 4組脊髓組織中MPO活性的比較Fig.2 Comparison of the MPO activity in the spinal cord tissues among the four groups

2.4 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中細胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示：Sham組脊髓切片上僅有極少量散在的凋亡細胞；與Sham組比較，SCI組、LQ-L組凋亡細胞數大量增加；與Sham組比較，LQ-H組凋亡細胞數量增加較少；，LQ-H、LQ-L組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，凋亡細胞均減少。見圖3。

圖3 4組脊髓組織中細胞凋亡情況 ×400Fig.3 Cell apoptosis in the spinal cord tissues in the four groups ×400

2.5 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中神經元丟失的影響

Nissl染色結果顯示（圖4A）：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組小鼠脊髓切片中神經元細胞密度均降低；LQ-L組、LQ-H組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，神經元細胞密度增加。

免疫熒光染色顯示（圖4B、4C）：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組caspase 3標記的神經元細胞數量明顯增加（P<0.05或0.01）；與SCI組比較，LQ-L組、LQ-H組caspase 3標記的神經元細胞數量明顯減少（P<0.05或0.01）；LQ-L組與LQ-H組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

圖4 4組脊髓組織中神經元丟失情況Fig.4 Loss of neurons in the spinal cord tissues in the four groups

2.6 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中MAPK通路蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組小鼠脊髓組織中p-ERK、p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達明顯上調（P<0.05或0.01）；與Sham組比較，LQ-H組p-ERK和p-JNK蛋白表達明顯上調（P<0.05），但p-p38 MAPK蛋白表達的差異無統計學意義（P>0.05）；與SCI組比較，LQ-L組、LQ-H組p-ERK、p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達明顯下調（P<0.05或0.01）；與LQ-L組比較，LQ-H組p-ERK和p-p38 MAPK蛋白表達明顯下調（P<0.05），但p-JNK蛋白表達的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 4組脊髓組織中MAPK通路蛋白的表達情況Fig.5 Expressions of the MAPK pathway proteins in the spinal cord tissues in the four groups

3 討論

本研究結果表明，甘草苷能顯著改善脊髓損傷小鼠的運動功能，這主要與減少細胞凋亡和炎癥反應有關。研究［10］報道，脊髓損傷后血脊髓屏障的破壞導致包括中性粒細胞在內的細胞浸潤，形成強烈的局部炎癥，導致細胞死亡和永久性神經功能障礙。本研究通過HE染色和檢測損傷組織中MPO活性，發現甘草苷可以顯著減小損傷后的炎癥區域和降低中性粒細胞的浸潤程度。本研究結果與既往甘草苷通過抑制炎癥損傷減輕野百合堿誘導的肝竇阻塞綜合征的研究［11］結果相似，證明甘草苷可通過抑制炎癥損傷和中性粒細胞浸潤，對小鼠脊髓損傷發揮神經保護作用。

凋亡是脊髓損傷后脊髓的一個顯著特征，表現為細胞核DNA斷裂和caspase激活［12］。本研究在損傷后的小鼠脊髓組織中檢測到凋亡的神經元，脊髓損傷后損傷部位的神經元可檢測到caspase激活。caspase是凋亡程序的重要執行者［13］，其中caspase 3可在各種類型的中樞神經系統細胞凋亡過程中被激活，其激活可能是中樞神經系統中的關鍵凋亡事件。本研究發現，脊髓損傷后神經元中的caspase 3被激活，表達活化caspase 3的神經元數量顯著增多，同時Nissl染色結果也顯示神經元密度降低。而在甘草苷治療后，caspase 3活化及神經元丟失情況明顯改善。結果說明，甘草苷對脊髓損傷的緩解作用至少部分是通過減少caspase 3的激活、抑制細胞凋亡實現的。

MAPK通路在脊髓損傷的病理生理學中起關鍵作用［3，7］。既往研究［14］表明，脊髓損傷后，MAPK信號通路在神經元、小膠質細胞/巨噬細胞和星形膠質細胞中被激活，并參與調節慢性疼痛。脊髓損傷后抑制MAPK通路可顯示不同的結果，如減輕炎癥或減少凋亡。研究［8］報道，甘草苷可通過抑制MAPK信號通路對心肌纖維化發揮保護作用。本研究結果表明，ERK、p38 MAPK和JNK的激活與脊髓損傷有關。值得注意的是，甘草苷治療顯著降低了脊髓損傷小鼠脊髓組織中ERK、p38 MAPK和JNK的磷酸化。結果證明，甘草苷在一定程度上是通過阻斷MAPK信號通路發揮作用的。

綜上所述，本研究結果表明，甘草苷可以顯著恢復脊髓損傷小鼠運動功能；此外，甘草苷顯著抑制脊髓損傷小鼠脊髓組織炎癥和神經元凋亡，這些作用主要是通過甘草苷對MAPK通路的抑制作用實現的。本研究結果提示，甘草苷可能對脊髓損傷具有一定的治療效果。