GRHL2對結腸癌失巢凋亡和侵襲遷移的作用研究

汪錦江，李佳曦，鄧周峰，劉子梅，喬光磊，馬俐君

(上海交通大學醫學院附屬同仁醫院 腫瘤科，上海 200336)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是女性中第二常見，男性中第三位常見的癌癥，是癌癥相關死亡的主要原因[1]。結直腸癌的發病機制受多因素影響，大部分死亡歸因于局部復發和遠處轉移。肝轉移不僅作為結直腸癌最易發生的轉移[2]，也是結直腸癌死亡的主要原因[3]。除此之外，對于轉移性癌細胞如何適應和定植新的組織環境知之甚少。因此，探究結直腸癌轉移的病理生理機理，對于了解轉移的機制，以及開發靶向治療CRC的藥物具有十分重要的意義。

失巢凋亡(Anoikis)是指當正常的上皮細胞失去了與細胞外基質的連接時觸發的一種特殊的程序性細胞死亡方式[4]。有研究表明腫瘤細胞抵抗失巢凋亡的能力決定了細胞脫離細胞外基質后的存活能力，這是惡性腫瘤獲得侵襲和轉移特性的前提[5-7]。上皮間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的過程被視為是對失巢凋亡發生的抵抗，促進了細胞轉移的過程。除了EMT之外，這種可塑性增強的另一個表現是腫瘤干細胞亞群的出現[8]，它們和發生EMT的細胞一樣，對失巢凋亡具有抗性，這些都是癌癥的復發和轉移的重要原因。

GRHL2是粒狀頭樣(GRHL)3個家族成員之一[9]，參與調控胚胎發育、上皮細胞分化、表皮屏障形成以及表皮損傷修復等一系列重要生命過程[10-12]，并可通過靶向上皮表型基因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和Claudin 4調控上皮頂端連接復合體的形成[13]。有研究報道了GRHL2在乳腺癌間質樣上皮細胞表達降低[14]。因此，GRHL2可能是EMT一個重要調控因子。但關于GRHL2在結直腸癌中對于細胞失巢凋亡的影響報道較少，且可能受制于以往研究技術的限制，GRHL2在腫瘤中復雜的功能尚未完全揭曉。因此，這次研究使用本課題組在前期研究中通過CRISPR/CAS9技術構建的GRHL2的沉默及回補細胞系來研究該基因對人結腸癌HCT116細胞侵襲遷移和失巢凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人結腸癌HCT116細胞株、GRHL2-KO細胞株以及GRHL2-KO基礎上過表達細胞株(GRHL2-OE)來自上海交通大學醫學院附屬同仁醫院馬俐君課題組(文章另發)。高糖DMEM和PBS購自美國GIBCO公司；胰酶和雙抗購自美國Hyclone公司；細胞培養皿、細胞培養板來自Coring公司；熒光定量試劑盒購自日本TAKARA公司；8.0 μm的transwell小室購自美國Millipore公司；失巢凋亡試劑盒購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組

用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養基培養HCT116細胞株、GRHL2-KO株和GRHL2-OE細胞株，在37℃、5%CO2的孵箱內培養。實驗分為3組：分別為HCT116對照組、GRHL2沉默組(GRHL2-KO)和GRHL2回補組(GRHL2-OE)。

1.3 qRT-PCR檢測GRHL2的mRNA表達

RNA抽提試劑盒抽提3組細胞的總RNA并測定濃度，然后用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。然后使用熒光定量試劑盒進行qRT-PCR。以β-actin為內參引物，上游引物：5′- CCTTCCTGGGCATGGAGTC -3′，下游引物：5′-GATCTTCATTGTGCTGGGTG -3′，GRHL2基因上游引物：5′-CGCCTATCTCAAAGACGACCAG -3′，下游引物：5′- CCAGGGTGTACTGAAATGTGCC -3′，實驗重復3次。

1.4 Western blotting

提取細胞的總蛋白，BCA法測取濃度，按20 μg/孔上樣進行電泳分離，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫封閉2 h后加入一抗(1∶500)，4℃搖床過夜，洗膜3次。二抗(1∶1000)室溫1.5 h，顯影曝光。使用Image J軟件對圖像進行定量分析。

1.5 光學顯微鏡觀測細胞形態

稀釋細胞懸液接種于培養皿中，待克隆長成，于鏡下觀察細胞形態并拍照。每組細胞隨機拍攝 5 個視野，實驗重復3次。

1.6 失巢凋亡實驗

每一步按照試劑盒要求進行，消化3組細胞，制成每毫升1×106的細胞懸液。在96孔抗錨板中每孔加入500 μl細胞懸液。在37℃、5%CO2的條件下培養48 h。每孔添加1 μl的Calcein AM (500X)和1 μl的EthD-1 (500X)的染料在37℃孵育1 h，后進行熒光檢測并拍照。吸光度Calcein AM為綠色 (Ex/Em=485/515 nm)，EthD-1為紅色 (Ex/Em=525/590 nm)。

1.7 劃痕實驗

細胞在六孔板中培養，待細胞長至匯合度90%左右，用200 μl的槍頭在兩組細胞分別均勻劃下，經PBS洗1遍換成無血清培養基。于培養0 h和48 h分別拍照。

1.8 侵襲遷移實驗

消化細胞離心后用無血清培養基重懸，以每孔1×105個細胞接種于Transwell小室內，上室500 μl培養基，下室加入800 μl完全培養基。轉移實驗培養24 h,侵襲實驗培養48 h。取出小室后用PBS漂洗，并用4%多聚甲醛固定30 min,最后結晶紫染色10 min,棉簽輕擦小室內壁干燥后放置在倒置顯微鏡觀察。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 驗證GRHL2基因沉默及回補的效果

與對照組細胞相比，GRHL2-KO組的mRNA和蛋白表達幾乎不表達；回補組細胞與沉默組細胞對比，mRNA和蛋白表達均明顯增加，差異均具有統計學意義(P<0.0001)。見圖1,2。

圖1 qRT-PCR法檢測GRHL2-KO及GRHL2-OE的mRNA表達情況,****P<0.0001

圖2 Western blot檢測實驗和對照組細胞中GRHL2蛋白的表達情況

2.2 沉默GRHL2對于細胞形態學的影響

對照與GRHL2-OE兩組細胞呈圓形或梭形，細胞之間排列緊密抱團生長。而相比之下GRHL2-KO組細胞多呈梭狀形態，黏附能力降低，克隆中呈松散狀態均勻散布，且細胞間空泡較多(見圖3)。

圖3 顯微鏡下觀察對照組、GRHL2沉默組以及回補組細胞的形態變化

2.3 沉默GRHL2對于失巢凋亡的影響

失巢凋亡作為細胞死亡的一種形式，對于腫瘤向遠處轉移有著重要的作用。Calcein AM/EthD-1 熒光雙染法檢測發現，與對照組相比GRHL2沉默后，存活細胞率明顯增加〔Calcein AM:(147.25±20.06)% vs(343.50±6.62)%,P<0.001〕，失巢凋亡率明顯減少〔EthD-1:(72.12±9.19)% vs(53.96±5.35)%,P<0.01〕；GRHL2回補后存活細胞率明顯下降〔Calcein AM:(343.50±6.62)% vs(119.73±14.48)%，P<0.0001〕,細胞失巢凋亡率明顯回升〔EthD-1:(2.25±0.10)% vs(53.96±5.35)%，P<0.001〕。見圖4。

圖4 Calcein AM/EthD-1 熒光雙染法檢測GRHL2沉默及回補后細胞失巢凋亡的變化 **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

2.4 沉默GRHL2對于細胞遷移的影響

為了探究GRHL2沉默后對結腸癌細胞遷移的影響，先后進行了劃痕實驗和侵襲遷移實驗。劃痕實驗取0 h和48 h作為觀測點。實驗結果顯示，48 h后GRHL2-KO組相較于對照組劃痕明顯變窄；回補組細胞相較于GRHL2-KO組的劃痕明顯更寬(見圖5)。侵襲遷移的結果顯示，GRHL2沉默組與對照組相比，細胞遷移、侵襲數顯著降低(P<0.001)；回補組細胞的遷移和侵襲數量明顯增加(P<0.001)(見圖6)，差異均有統計學意義。

圖5 劃痕實驗顯示沉默GRHL2促進細胞的遷移而回補組細胞抑制細胞遷移

圖6 侵襲遷移實驗顯示沉默GRHL2增加HCT116細胞侵襲遷移能力而回補組細胞侵襲遷移能力下降

2.5 GRHL2表達沉默和基因回補對細胞內E-cadherin、N-cadherin和RAB25表達的影響

與對照組相比，GRHL2-KO組的western blot結果顯示E-cadherin以及RAB25表達量明顯下降，而N-cadherin的表達增加；而在GRHL2基因回補組，E-cadherin以及RAB25的蛋白恢復表達，N-cadherin表達相對下降(見圖7)。

圖7 Western blot 檢測E-cadherin、N-cadherin和RAB25蛋白表達情況

3 討論

結直腸癌是最常見的胃腸道腫瘤，也是癌癥相關死亡的主要原因。預計在2022年，結直腸癌占近一半 (48%) 的男性新發病例，對女性來說，乳腺癌、肺癌和結直腸癌占所有癌癥的 51%新發病例[15]。根據最新的基于國家癌癥中心(NCC)結直腸癌多學科專家小組設計的CorCCRES調查研究報告顯示，從2005年～2014年的10年間，我國人均結直腸癌相關支出上升了近2倍，且一經確診就為晚期的結直腸癌患者比例有所增加[16]。

在結直腸癌中，EMT在腫瘤進展、轉移和耐藥性中具有重要作用。來自臨床前和早期臨床研究的越來越多的證據表明，EMT 標志物可能作為結直腸癌的預測因子和潛在的治療靶點[17]。癌細胞從原發性腫瘤中分離出來，進入循環系統中進行轉移的過程中發生的細胞死亡被稱為失巢凋亡[18]，其在腫瘤發生和轉移等方面起重要作用。癌細胞具有逃避失巢凋亡的能力[18]，對失巢凋亡的抗性是高度侵襲性結直腸癌細胞的關鍵特征[19]。癌相關的成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs) 是腫瘤和宿主之間的一種微環境組分，研究者Schafer和其同事通過研究揭示了CAFs在通過分泌胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)阻斷失巢凋亡中發揮的作用，通過利用IGFBPs的精確分子機制可以抑制失巢凋亡的發生[20]。作為“細胞自殺”的一種形式，細胞程序性死亡的失巢凋亡會殺死游離上皮細胞，但在癌細胞轉移過程，癌細胞必須抵抗失巢凋亡從而進化表達蛋白質TrkB受體，使他們能夠在失巢凋亡作用下生存[21]。目前關于失巢凋亡在結直腸癌轉移中的分子機制仍不清楚。

粒狀頭樣2(graineyhead-like-2，GRHL2)是粒狀頭樣(graineyhead-like，GRHL)家族成員之一，作為一個新型轉錄因子在腫瘤的發生發展中起到重要作用[22-23]。在先前的綜述中，闡述了GRHL2在腫瘤中作為雙刃劍的作用[24]。GRHL2 已被證明可以抑制人結直腸癌細胞中的上皮間質轉化(EMT)[25- 26]。在EMT過程中，細胞的E-鈣黏蛋白被N-鈣黏蛋白取代，腫瘤細胞中的EMT過程的出現成為腫瘤侵襲、轉移最為關鍵的一步[27]。但GRHL2與結腸癌細胞EMT過程以及失巢凋亡的關系仍不清楚。本研究首次在結直腸癌細胞系中采用CRISPR/Cas9對GRHL2進行基因沉默。失巢凋亡實驗結果表明GRHL2的沉默會抵抗結腸癌HCT116細胞失巢凋亡，而回補GRHL2會恢復對失巢凋亡的敏感性。

蛋白印跡實驗結果提示GRHL2的沉默抑制了EMT過程中的關鍵分子E-cadherin的表達，上調了N-cadherin的表達，從而促進了EMT的發生。同時，GRHL2的沉默抑制了其下游靶向基因RAB25[28]的表達，而RAB25的下調可通過調節囊泡轉運和細胞運動[29]，促進細胞侵襲從而使細胞向遠處轉移。GRHL2的回補提示E-cadherin和RAB25的蛋白恢復，提示細胞的MET[30]過程。

綜上所述，通過CRISPR沉默GRHL2后失巢凋亡抗性增強，細胞侵襲轉移能力增強；而回補GRHL2的表達可逆轉這些過程。從而提示GRHL2是治療轉移結直腸癌的一個新潛在靶點。未來還需更多的研究來探究GRHL2作為靶點開發新型靶向療法的臨床價值。