雙氫青蒿素對TGF-β1刺激的子宮內(nèi)膜上皮細胞中uPA和PAI-1含量的影響

宋玉杰，單鐵英，馬景紅，李 玲，李 偉，商小涓，栗志英

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 婦科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學(xué)，a 醫(yī)學(xué)院，b 附屬醫(yī)院，c 國際交流學(xué)院，河北 邯鄲 056002)

近年來，因?qū)m腔黏連導(dǎo)致女性不孕的患者日漸增多[1]，雖然日益先進的輔助生殖技術(shù)解決了許多不孕的難題，但是對于嚴重的宮腔黏連仍然沒有很好的治療方案。目前，關(guān)于宮腔黏連的病因和發(fā)病機制尚沒有統(tǒng)一的觀點，宮腔黏連的病理學(xué)改變特點為子宮內(nèi)膜組織發(fā)生纖維化改變。許多文獻已經(jīng)證實，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)參與了心臟、肝臟、肺臟以及腎臟等多種器官的組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展[2-5]。本課題組前期實驗數(shù)據(jù)表明，經(jīng)TGF-β1作用的子宮內(nèi)膜上皮細胞(EECs)分裂能力增強，并具有肌成纖維細胞分子標志和生物學(xué)活性[6]，但是采用中藥雙氫青蒿素(DHA)干預(yù)后，EECs的增殖、細胞分子標志和生物學(xué)活性會出現(xiàn)何種變化尚不清楚。以前期實驗結(jié)論為基礎(chǔ)，本研究進一步分析DHA 對TGF-β1 誘導(dǎo)的EECs的分裂能力以及細胞中尿型纖溶酶原激活劑(uPA)和纖溶酶原激活劑抑制因子-l(PAI-1)含量的變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑選取2020年2月1日—2020年6月20日在邯鄲市中心醫(yī)院婦科宮腔鏡室獲取因經(jīng)期不規(guī)則做刮宮的婦女，年齡35-45 歲，刮宮日期前一年內(nèi)無激素類用藥史。組織切片顯示：正常，且處于增生期。摘取的內(nèi)膜組織必須盡快投進冰冷的培養(yǎng)液中，盡快運送到無菌實驗臺里。整個過程屬于無菌操作。

DHA 購買自浙江新和成股份有限公司，TGF-β1 購自上海雙贏生物科技有限公司，角蛋白抗體、uPA和纖PAI-1抗體均購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；檢測細胞分泌活性的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1獲取內(nèi)膜組織中的EECs 沖洗干凈獲取的子宮內(nèi)膜組織碎塊，向其中加入膠原酶溶液，沒過組織碎塊，在常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中作用35 min，經(jīng)80目的濾網(wǎng)篩出的含有子宮內(nèi)膜細胞的液體置于6 cm半徑的離心機中，調(diào)到轉(zhuǎn)速為600 r/min持續(xù)轉(zhuǎn)動經(jīng)孵育液12 min，離心所得的沉積物，經(jīng)培養(yǎng)液懸浮后即為子宮內(nèi)膜上皮細胞，放入含有適量濃度的血清孵育液中常規(guī)培養(yǎng)，取少許細胞用于類型鑒定和形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.2細胞分組 按照培養(yǎng)液中加入干預(yù)試劑不同，細胞分為4組，對照組：按照常規(guī)方法進行培養(yǎng)；TGF-β1 組：在常規(guī)培養(yǎng)液中加入TGF-β1；DHA組：在常規(guī)培養(yǎng)液中加入DHA；TGF-β1+DHA 組：在TGF-β1 組的基礎(chǔ)上加入DHA。TGF-β1在培養(yǎng)液中的最終含量為10 ng/mL，DHA在培養(yǎng)液中的最終含量為100 ng/mL。4組細胞同時放入細胞培養(yǎng)箱中，孵育時間均為48 h。

1.2.3細胞增殖實驗 將每mL培養(yǎng)液里包含細胞數(shù)量為4×104個的上述4組EECs，以200 μl的量滴入有96個孔的細胞培養(yǎng)板中，按照上述1.2.2分組，每1組含有6個復(fù)制孔。放入細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，置于無菌超凈臺中向每孔中加入噻唑藍溶液，再次放回培養(yǎng)箱作用4 h。吸出各個孔的溶液只留下孔底細胞，再向其孔內(nèi)滴入二甲基亞砜，噻唑藍和二甲基亞砜的加入量遵循細胞增殖實驗的使用說明書。輕輕搖動96孔板10 min，置于適當波長的檢測儀中記錄每孔的吸光度值。

1.2.4ELISA 測定細胞的分泌活性 4組細胞的孵育液中含有細胞分泌的物質(zhì)，認真按照說明書中的步驟進行依次操作，測出4 組細胞孵育液中的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量。

1.2.5檢測細胞中uPA和PAI-1的蛋白含量 通過蛋白印跡的方法進行檢測，具體如下：獲取各組細胞中的蛋白質(zhì)，吸取純度合格的30 μg蛋白加入特定濃度的緩沖液，熱變性后，滴入固體膠的一端進行電泳，獲取膠中含有目標蛋白的條段，在轉(zhuǎn)膜儀中，將膠中的目標蛋白移到膜中，膜經(jīng)過封閉后，先后與適量濃度的第一抗體(uPA和PAI-1)、第二抗體溶液反應(yīng)。放入暗室中加發(fā)光液后，顯影并定影于X光片中，通過專門的軟件分析X光片中的目標蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 細胞類型鑒定和形態(tài)觀察剛分離的EECs常呈現(xiàn)葡萄串狀、團狀聚集在一起，培養(yǎng)5天后，細胞緊貼瓶底部呈鋪展性生長，體積較大，卵圓形，先后經(jīng)堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅染色后清晰分辨出細胞中央藍色的卵圓形細胞核，核周圍的紅色細胞質(zhì)。細胞被角蛋白免疫染色呈現(xiàn)陽性(圖略)。

2.2 細胞增殖實驗分析DHA組與對照組的吸光度值相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1組的吸光度值明顯高于對照組(P<0.05)； TGF-β1+DHA組的吸光度值明顯低于TGF-β1組(P<0.05)。與對照組相比，DHA組中Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量無明顯差異(P>0.05)，TGF-β1組孵育液中兩種細胞分泌物的含量均顯著上升(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+DHA組孵育液中兩種細胞分泌物的含量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 細胞增殖和分泌活性的分析

a與TGF-β1組相比,P<0.05；b與對照組相比,P<0.05；c與對照組相比,P>0.05。

2.3 細胞中uPA和PAI-1蛋白含量分析與對照組相比，DHA組細胞中uPA和PAI-1蛋白的含量無明顯差異(P>0.05)，TGF-β1組細胞中uPA含量減少，而PAI-1含量增加(均P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+DHA組細胞中uPA含量增加，而PAI-1含量減少(均P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 蛋白印跡觀察4組細胞中uPA和PAI-1蛋白的灰度

表2 細胞中uPA和PAI-1蛋白的灰度值分析

3 討論

正常婦女在生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜組織會隨著月經(jīng)周期的變化其厚度也發(fā)生周期性的變化，即剝脫出血、增生修復(fù)[7]。確保其發(fā)生周期性變化是雌激素、孕激素含量的多少和子宮內(nèi)膜組織的基底層的增生修復(fù)功能[8]。已有文獻表明，宮腔黏連的發(fā)生源于許多有害因素造成子宮內(nèi)膜的深部基底層組織損傷。因此，內(nèi)膜組織不能進行正常的修復(fù)過程，而是出現(xiàn)了異常增多的結(jié)締組織，其中含有因分解能力降低而大量堆積的細胞之間的基質(zhì)成分，也就是內(nèi)膜組織發(fā)生纖維化改變[9-10]。

TGF-β是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的超家族。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它包含有3個成員，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β為導(dǎo)致機體多種器官組織發(fā)生纖維化改變的起關(guān)鍵作用的細胞因子，其中TGF-β1為生物學(xué)活性最強的成員。如果組織中TGF-β1含量異常增高，那么其發(fā)生纖維化的進程就會越快。文獻研究顯示，它不但會刺激間質(zhì)細胞分裂增殖并向細胞外大量釋放基質(zhì)成分[11]。而且會刺激上皮細胞的表型和生物學(xué)活性向間質(zhì)細胞的方向發(fā)生改變[12]。來源于腎小管管壁中的上皮細胞在體外培養(yǎng)時，加入TGF-β1后，細胞的形態(tài)、分子標志以及活性均向間質(zhì)細胞的趨向轉(zhuǎn)變[13]。本課題組的前期實驗結(jié)果也證明經(jīng)TGF-β1作用的子宮內(nèi)膜上皮細胞(EECs)分裂能力增強，并具有肌成纖維細胞分子標志和生物學(xué)活性[6]。這次的研究數(shù)據(jù)也表明了EECs在TGF-β1的作用下數(shù)量增加，并向孵育液中釋放大量的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白。這與上述的研究結(jié)果相一致。

機體器官組織中細胞外基質(zhì)的正常生理代謝過程比較復(fù)雜，需要多種蛋白酶類對其進行降解，還需相應(yīng)的抑制劑拮抗其過分的降解，這樣才能保持其在組織中的正常含量。其中包括在基質(zhì)成分代謝過程中起關(guān)鍵作用的蛋白酶激活劑和其對應(yīng)的抑制劑：uPA和PAI-1，PAI-1是uPA特異的抑制劑[14-15]。uPA作為分解基質(zhì)成分的蛋白酶激活劑，具體的作用機制如下：①作用于纖溶酶原使其具有生物學(xué)活性，分解基質(zhì)成分中的多種蛋白質(zhì)；②作用于纖溶酶，使其具有分解基質(zhì)成分中的多種蛋白質(zhì)外，還具有分解上皮組織與結(jié)締組織之間的基底膜；③作用于基質(zhì)金屬蛋白酶原使其具有生物學(xué)活性，分解基質(zhì)蛋白質(zhì)成分[16-17]。PAI-1對uPA的生物學(xué)活性具有特異性的抑制作用，二者的分子結(jié)合后，能拮抗uPA上述分解基質(zhì)成分的功能[18-19]。

腎臟組織發(fā)生病變的患者，損傷組織里的uPA含量減少，PAI-1含量增加，會導(dǎo)致細胞之間的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)成分增多，腎臟組織發(fā)生纖維化改變[20]。在小鼠實驗中顯示，肝臟組織中的uPA 及其受體含量增高時，細胞之間的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)成分的分解能力顯著增強；但如果小鼠被敲除uPA 基因后，肝臟組織會很快出現(xiàn)程度較重的纖維化改變[21]。本研究在TGF-β1刺激發(fā)生纖維化的子宮內(nèi)膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，細胞的數(shù)量增加，孵育液中Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量增加，細胞中uPA含量減少，而PAI-1含量增加(均P<0.05)。由此可以說明uPA具有正向調(diào)節(jié)上皮細胞纖維化改變的過程，而PAI-1具有拮抗uPA的作用。

DHA是青蒿素的一種衍生物，是中草藥青蒿素中獲得并經(jīng)過加工而成的一種生物活性物質(zhì)[22]。文獻報道DHA的藥理學(xué)作用較為廣泛，它具有改變免疫系統(tǒng)的活性、消滅腫瘤細胞以及降低炎癥反應(yīng)等作用[23-25]。動物實驗表明，雙氫青蒿素能作用于肺臟間質(zhì)組織中的成纖維細胞，抑制其增殖能力和生物學(xué)活性，也就是說使成纖維細胞合成和向細胞外釋放的基質(zhì)含量減少，從而改善肺臟組織的纖維化損傷[26]。肝組織發(fā)生纖維化病變的大鼠服用雙氫青蒿素一段時間后，病理切片發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟組織中的纖維化的病變得到減輕，免疫組織化學(xué)染色可見，肝組織中的Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白等基質(zhì)蛋白成分的含量減少，評估肝功能的臨床指標也得到相應(yīng)的恢復(fù)[27]。本實驗結(jié)果表明，雙氫青蒿素能拮抗TGF-β1作用的EECs數(shù)量增加，細胞中uPA含量減少和PAI-1含量增加。最終達到釋放Ⅰ型膠原及纖黏連蛋白的含量下降。這提示雙氫青蒿素能有效阻止TGF-β1導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜纖維化改變即防止宮腔黏連。