基于PI3K/Akt通路探究下調miR-206對肋骨骨折模型大鼠骨折愈合的影響

王 強，高書軍*，趙鵬飛，劉 巖

(1.河北省張家口市第二醫院麻醉科，河北 張家口 075000；2.河北省張家口市第二醫院骨科，河北 張家口 075000)

肋骨骨折是最常見的鈍性胸外傷后損傷，會增加肺部感染及死亡的風險，尤其是老年人預后更差[1-2]。MicroRNAs (miRNAs)通過靶向結合mRNA負向調控基因表達[3]，與胚胎發育、器官形態、腫瘤發生和細胞分化密切相關[4]。以往研究表明，miR-206 可以通過靶向PI3K/Akt通路發揮調控脂肪細胞新生、血管形成等生物學過程[5-6]，但其在骨折愈合中的作用尚不明確。另一方面，磷脂酰肌醇3-激酶The phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路在促進成骨細胞增殖、分化以及骨質沉積中發揮了重要作用[7-8]。因此本研究建立大鼠肋骨骨折模型，研究下調miR-206通過PI3K/Akt通路發揮骨折愈合的具體機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 10周齡SPF級雄性SD大鼠(200±20)g共32只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK(京)2014-0001。大鼠飼養于屏蔽環境內，恒溫22～24 ℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h。

1.2大鼠肋骨骨折的建模及分組 使用異氟烷麻醉(1%～2%)大鼠，將其置于右側臥位，分層切開皮膚、分離皮下組織和肌肉,剝開骨膜, 暴露出第6肋骨，并橫向切斷, 使肋骨自由移動，然后分層對位縫合。手術后令大鼠恢復1 d后；隨機將手術后的大鼠分為對照組(control)和miR-206組，每組各16只。miR-206組的大鼠在骨折斷端注射miR-206抑制劑(miR-206 inhibitor，50 μg，30 μL，由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司提供)，對照組僅注射等量生理鹽水，連續注射7 d，具體注射方法及劑量均參照已發表文獻[9]。

1.3micro-CT檢測 在手術后的14、28 d對大鼠的肋骨骨折部位進行掃描。使用vivaCT40 micro-CT掃描感興趣區域(VOI，以骨折斷端為中心包含周圍骨痂)，X 射線管獲取顯微斷層掃描切片(能量/強度為70 kVp/114 μA)，35 μm體素尺寸進行3D重建。3D高斯濾波器 (σ = 0.8, support = 1) 降噪。掃描結束后用Micro-CT自帶的軟件進行定量分析，使用二維建模分析每一層軸位片上骨痂總面積(total callus area，TA)及骨性骨痂面積(bone area，BA)，并通過三維分析獲得所有層面骨痂總體積(total callus volume，TV)，骨性骨痂體積(bone volume，BV)，以及骨體積分數(BV/TV)。

1.4Western Blot 采用Western Blot法檢測Akt及PI3K蛋白水平。使用Minute(TM) 骨組織總蛋白提取試劑盒(Invent，美國)，對骨總蛋白進行提取，測定蛋白濃度并加入4×SDS蛋白上樣緩沖液(按1∶3的比例)煮沸后備用。每孔加入20 μg樣品或6 μL Marker進行電泳，濃縮膠電壓80 V，25 min，分離膠電壓120 V，50 min，電泳后轉膜，3%脫脂牛奶(體積分數0.5%TBST)封閉1 h。孵育一抗，分別用Akt兔單克隆抗體(1∶1 500)、PI3K兔單克隆抗體(1∶1 500)，β-actin兔單克隆抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。后以TBST洗3次。二抗用山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室溫下孵育30 min后，TBST洗3次，5 min/次。ECL曝光顯影，Image J圖像處理軟件分析結果。

1.5qPCR檢測Akt、PI3K及miR-206表達水平 采用Trizol法提取骨樣本的總RNA，Nanodrop測定RNA濃度后按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。qPCR反應體系為20 μL；上游和下游引物各(10 μmol/L)，1.0 μL，cDNA 2.0 μL，SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，35個循環。熔解曲線：95℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，每個樣品設3個技術重復，結果采用2-△△Ct法分析mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 qPCR實驗所用引物Table 1 Primers for qPCR assay

1.6統計學方法 應用SPSS 27.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠術后的一般狀態 miR-206組和對照組共32只大鼠均成活并造模成功。2組造模后的大鼠術后第1天均活動自如，進食、飲水正常。術后1周，大鼠傷口局部紅腫逐漸消退，傷口未出現發炎情況。

2.2骨組織愈合情況比較 Micro-CT結果顯示自14 d開始，2組均有骨痂開始形成，至28 d骨痂塑形改建，說明隨著時間推移兩組的骨折均有不同程度的愈合。2組CT 2D和3D重建的結果均顯示，14 d和28 d時miR-206注射組骨痂量較對照組明顯增加，骨干趨于正常，骨密度更高；而對照組在28天時仍未愈合(圖1)。此外，Micro-CT結果顯示各組大鼠的骨痂總體積、骨性骨痂體積、骨骼體積比均隨時間逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，miR-206干預后，在不同時間點均明顯促進了骨痂的形成和骨折的愈合，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖1 不同時間點2組大鼠肋骨骨折部位CT掃描及重建圖Figure 1 CT scans and reconstructions of the rib fractures of rats between two groups at different time points

表2 不同時間點兩組大鼠骨痂愈合指標比較Table 2 Comparison of callus healing indexes of rats between two groups at different time points

2.32組大鼠骨組織miR-206、Akt及PI3K表達量不同時間點的比較 qPCR檢測2組大鼠肋骨組織中miR-206、Akt及PI3K表達量，與對照組相比，miR-206抑制劑干預后，不同時間點的miR-206表達量均顯著下調；而Akt及PI3K表達量與對照組比較均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 2組大鼠骨組織miR-206，Akt及PIK3表達量不同時間點的比較Table 3 Comparison of the expression levels of miR-206, Akt and PIK3 in the bone tissues between two groups at different time points

2.42組大鼠肋骨組織Akt及PI3K蛋白水平不同時間點的比較 免疫印跡法檢測不同時間點大鼠骨組織中的Akt及PI3K蛋白水平如圖2所示。與對照組比較，miR-206干預不同時間后，Akt及PI3K的蛋白含量均明顯升高(P<0.05)，見圖2，表4。

圖2 不同時間點大鼠肋骨中Akt及PI3K的蛋白量變化Figure 2 Changes in the protein levels of p-Akt and p-PI3K in the ribs of rats at different time points

表4 不同時間點大鼠肋骨中Akt及PI3K的蛋白量變化Table 4 Changes in the protein levels of Akt and PI3K in bone tissues of rats at different time points

3 討 論

肋骨骨折是胸部損傷中常見的并發癥之一，其特點具有發病急、病情擴展迅速、致死率高等[10]。其對肺臟、心臟、血管、神經等造成的損傷往往會造成嚴重的后果，甚至會危及生命。因此，亟待開發出針對新靶點的治療策略。已有大量文獻報道了miRNAs 在調節骨折愈合過程中的成骨分化和成骨修復中起了重要的作用[11]。miRNA是長度為19～25個核苷酸的短鏈非編碼RNA分子，首次在秀麗隱桿線蟲中被發現，廣泛分布于植物和動物體內，參與DNA翻譯后的轉錄抑制過程[12]。其具體機制為，miRNA與信使RNA 3 ′UTR的結合區域稱為種子區，miRNA與種子區的完全互補結合可導致靶標mRNA的降解，而不全的互補配對可導致翻譯抑制[13]。miR-206最初被發現是一種參與肌肉分化過程的特異miRNA，然而，近年來亦有文獻報道miR-206表達于成骨細胞，因此可能參與了成骨細胞中的生物學過程[14]。這也在其文獻中得到驗證。Xie等[14]研究發現，在成骨細胞過表達miR-206能夠抑制其分化成熟，相反，沉默miR-206能夠促進成骨細胞的分化，其具體機制為間隙連接蛋白connexin-43(Cx43)為miR-206的靶基因，而Cx43主要分布于神經肌肉接頭處，在胚胎期調控了肌肉骨骼的發育，因此當其受到miR-206的負向調控時可以抑制骨骼發育；在體研究表明，miR-206轉基因小鼠表現出骨量降低、骨皮質變薄[15]。以上這些研究表明了miR-206與骨細胞的分化和骨質沉積關系密切。但其在骨折愈合中的作用尚不明確，miR-206可能在骨折中發揮了負向調節的作用。本研究應用大鼠肋骨骨折模型，探討miR-206在骨折中表達的動態變化和其生物學功能，結果表明隨著骨折的愈合，miR-206的表達量逐漸降低；且通過注射miR-206抑制劑降低其表達，可以顯著促進肋骨骨痂的形成和骨折的愈合過程，明確了miR-206在大鼠肋骨骨折的愈合過程中，能夠抑制骨痂形成和骨質沉積，從而發揮抑制作用。

PI3K/Akt信號通路是生物體內最重要的信號通路之一，在調控葡萄糖代謝、細胞凋亡、細胞增殖、轉錄和細胞遷移等多種生物學過程中，發揮了至關重要的作用[16]。PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate，PIP2]為磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphate，PIP3]，PIP3 作為第二信使可以激活 AKt 并一步調控下游的細胞生物學過程[17]。在骨骼系統中，越來越多的證據表明PI3K/Akt通路作為成骨細胞和破骨細胞分化成熟的關鍵調節因子，可以通過促進兩類細胞的存活和分化，從而調節骨代謝水平并維持骨量的平衡[18-19]。例如，Sanchez-Gurmaches 等[20]研究發現Akt1/Akt2 雙基因敲除小鼠可表現出骨化延遲及骨骼的畸形，Zhao等[21]研究發現Akt1敲除小鼠的股骨長度較野生型短，且次級骨化中心形成延遲。此外，Li等[22]發現在骨折愈合過程中，Akt可以促進骨痂的形成，增強股骨的機械性能從而發揮促進骨骼愈合的作用。以上研究結果說明Akt的激活可能能夠通過調節成骨細胞和破骨細胞之間的動態平衡，從而發揮促進骨折的愈合的作用。本研究的結果顯示，隨著骨折愈合過程的進展，PI3K和Akt的蛋白含量逐漸升高，表明了PI3K/Akt通路的激活，并參與了骨痂形成和骨礦物質沉積，與以往的文獻報道一致。另一方面，以往的研究亦表明，miR-206 可以通過靶向c-Met 蛋白，從而調控其下游PI3K/Akt通路的活性，繼而發揮調控脂肪細胞新生、腫瘤細胞增殖、血管形成等生物學過程。因而推測miR-206在骨折愈合中，可能通過與PI3K/Akt信號通路發生交互作用，從而影響骨痂形成和骨質沉積最終干預骨折的愈合。本研究的結果顯示，通過向肋骨骨折斷端注射miR-206抑制劑，不僅可以顯著降低肋骨組織中miR-206的表達水平，并且能夠進一步升高PI3K、Akt的mRNA和蛋白水平，這表明下調miR-206能夠使PI3K/Akt信號通路將進一步活化，從而發揮加速肋骨骨折愈合的分子生物學功能。

綜上所述，本研究表明在大鼠肋骨骨折模型中，下調miR-206能夠促進大鼠肋骨骨折的恢復，其作用機制與PI3K/Akt通路有關。但骨折愈合過程機制復雜，參與的信號通路眾多。因此miR-206促進肋骨骨折愈合機制仍需要進一步的探索。