外周血miR-200c水平對移植異基因造血干細胞后急性移植物抗宿主病發生的預測作用

武 坤，聶 波，李云濤，楊金榮，程沈菊，李艷紅，史明霞*

(昆明醫科大學第一附屬醫院 1.醫學檢驗科; 2.血液科，云南 昆明 650032)

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantation，allo-HSCT)是利用供者持久而穩定的細胞移植體發揮抗疾病效應，移植成功后受者造血及免疫功能改善，處于嵌合狀態時能夠維系終身[1-2]。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)是allo-HSCT常見并發癥，臨床治療雖有多種方案，但是效果欠佳，盡快找到評估aGVHD發生的因子對早期改善疾病具有重要幫助[3]。

隨著生物分子靶向研究不斷深入，微小RNA已經成為研究的熱點。miR-200c基因簇定位于12號染色體p13.31，在多種腫瘤細胞中表達異常，例如在乳腺癌、惡性膠質瘤中水平下調，可調節腫瘤細胞生物學行為[4]。文獻證實，腎移植大鼠體外實驗研究表明被轉化因子激活的長鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)能夠通過上調miR-200c表達而降低移植后急性排斥反應，其研究機制與抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號通路相關[5]。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2018年10月在昆明醫科大學第一附屬醫院血液科行allo-HSCT的51例患者作為研究對象，男性33例，女性18例，年齡10～47歲，中位年齡36歲。根據移植后是否發生aGVHD原則分為實驗組(發生aGVHD)33例，對照組(未發生aGVHD)18例，所有患者或家屬均知曉本文研究內容，自愿簽署知情同意書[倫理號：(2021)倫審L條10號]。

1.2 方法

1.2.1 預處理方案：全相合移植患者采用改良白消安+環磷酰胺(BUCY)為預處理方案；采用環孢素+甲氨蝶呤預防aGVHD。半相合移植患者采用依托泊苷+白舒非+環磷酞胺+抗胸腺細胞球蛋白為預處理方案；采用環孢素+嗎替麥考酚酯+甲氨蝶呤預防aGVHD。

1.2.2 aGVHD治療方案：當患者發生aGVHD時，立即給予甲波尼龍1～2 mg/(kg·d)，同時將環孢素調整至初始劑量，給藥5 d后觀察療效，無效者加用巴利昔單抗、他克莫司等二線治療。

1.2.3 miR-200c引物的設計與合成：引物序列由上海生工設計并合成，目的基因：miR-200c引物上游:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6引物上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游:5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 RT-qPCR 檢測患者外周血中miR-200c相對表達：抽取患者肘部外周血5 mL置入加有抗凝劑的離心管中，離心力2 054×g、離心10 min，分離血清，-80 ℃低溫保存。使用ReverTraAceqPCR RTKit返轉錄試劑盒定量檢測RNA。反應體系為15 μL，5 μL RNA模板，3 μL miR特異型莖環引物及U6進行定量PCR擴增。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，60 ℃退火60 s，72 ℃ 45 s，循環40次，每個循環后收集1次熒光，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，連續檢測熒光后進行產物分析。用2-ΔΔCt的方法計算相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者均移植成功，且恢復造血功能，恢復時間為18 d，其中33例出現aGVHD，發生率為64.71%，兩組性別、移植年齡分布、疾病類型、預處理方案、移植情況和供受者性別比較無差異(表1)。

2.2 RT-qPCR檢測兩組移植前后不同時間點miR-200c表達

實驗組在移植前、移植后7、14、及72 d 時miR-200c表達均低于對照組(P<0.05)，在移植后28 d時兩組無差異(表2)。

2.3 aGVHD發生前后miR-200c表達

對33例aGVHD發生后外周血中miR-200c為(2.23±0.25)顯著低于發生前的(1.02±0.10)(P<0.001)。

表1 一般資料比較Table 1 Comparison of general data[n(%)]

表2 兩組移植前后不同時間點miR-200c表達Table 2 Expression of miR-200c at different time points before and after transplantation in the two groups

2.4 不同aGVHD嚴重程度的miR-200c表達

與aGVHD Ⅰ度相比，Ⅱ度aGVHD患者外周血中miR-200c表達下調(P<0.001)，與Ⅱ度相比，aGVHD Ⅲ度患者外周血中miR-200c表達下調(P<0.001)(圖1)。

*P<0.001 compared with aGVHD Ⅰ degree; #P<0.05 compared with aGVHD Ⅱ degree圖1 不同aGVHD嚴重程度的miR-200c表達Fig 1 miR-200c expression in different aGVHD severity levels

2.5 miR-200c對aGVHD疾病的預測價值分析

移植28 d時，miR-200c ROC曲線下面積為0.850，敏感性為84.50%，特異型為81.2%，AUC=0.785，95%CI：0.669～0.837，Cutoff值為：0.93(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-200c對aGVHD的預測Fig 2 Prediction of aGVHD by miR-200c

2.6 生存分析

33例移植后28 d時發生aGVHD患者miR-200c水平為0.95±0.04，以均值(0.95)為基線，<0.95視為miR-200c低表達(19例)，≥0.95視為miR-200c高表達(14例)，對發生aGVHD所有患者隨訪2年，高表達組2年總生存率為71.43%(10例)，低表達組2年總生存率為50%(7例)，高表達組患者2年總生存率高于低表達組，組間比較存在差距(P<0.05)(圖3)。

圖3 兩組患者2年生存率分析Fig 3 2-year survival rate analysis of patients in the two groups

3 討論

aGVHD是allo-HSCT移植后100 d內發生的排斥反應，發生原因可能與移植患者進行強效預處理而導致消化道系統及皮膚黏膜排斥反應有關[6]。aGVHD發生的重要機制是供者移植物中T細胞對受試者主要及次要組織相容性抗原的差異識別發揮在抗原遞呈現細胞內表達作用[7]。部分學者提出miR在供者T細胞攻擊宿主過程中可能存在潛在的破壞靶細胞作用[8]。本文證實，aGVHD發病者外周血中miR-200c表達下調。miR-200c在腎移植動物體內表達下調，通過靶向調節其表達水平能夠發揮抗急性排除作用，miR-200c能夠通過下調TLR4信號改善免疫排除[9]。在器官移植患者中采用流式細胞儀檢測TLR4表達，發現出現急性排斥患者TLR4表達上調，miR-200c 能夠抑制移植者血清中炎性細胞因子表達，阻斷核因子(NF-kB)活性減少急性排除時發生的炎性反應。

十八屆歐洲血液學會上證實allo-HSCT移植后發生aGVHD疾病患者血液中多個miR出現表達異常，例如miR-146a等在其中呈現高表達，miR-3168呈現低表達[10]。本研究表明miR-200c在aGVHD發生后表達量低于未發生aGVHD疾病，推測miR-200c水平改變與移植者造血系統重建、供者T淋巴細胞攻擊受者組織發生大量炎性反應誘導aGVHD發生有關。aGVHD患者當伴隨機體感染時機體血清炎性因子表達上調，并隨著aGVHD嚴重程度而升高，說明miR-200c具有通過調節炎性信號通過而降低免疫排斥，降低aGVHD疾病程度[11]。

對白血病及淋巴瘤患者進行allo-HSCT移植后患者發生aGVHD疾病，采用臨床化學療法治療后復發率仍較高。對allo-HSCT移植后aGVHD患者5年生存率進行分析，高表達miR-155a GVHD患者生存率顯著低于低表達者[12]。本文研究aGVHD復發率高于未患有aGVHD者，ROC曲線分析顯示miR-200c診斷效能較強。miR-200c對肝癌患者臨床敏感性及特異性較高，但也與miR-200c不同亞型、檢測方法及樣本量存在相關性。miR-200c在血液腫瘤及aGVHD疾病的診斷相關文獻尚未報道，但對異基因造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病有一定預測作用[13-14]。

綜上所述：miR-200c水平降低與異基因造血干細胞移植后aGVHD的發生相關，隨著aGVHD嚴重程度升高其表達水平降低，miR-200c低表達患者生存率較差，說明外周血中檢測miR-200c可作為早期診斷和預測aGVHD的生物標志物。