八大香型風(fēng)格新鮮煙葉代謝特征的生態(tài)成因分析

周會娜，劉萍萍，張玉霞，王寶林，鄭慶霞，賈國濤，羅登山，姚 倩，喬學(xué)義，張俊嶺*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州市榆林南路16 號 450000

代謝組學(xué)是對某生物或細胞在特定生理時期內(nèi)所有代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析的一門學(xué)科［1-2］。煙草代謝物是煙草品質(zhì)構(gòu)成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其水平除受栽培品種影響外，還與土壤、海拔高度以及溫度、日照時數(shù)、降雨量等氣候條件相關(guān)［3］。連培康等［4］分析了貴州烏蒙煙區(qū)不同海拔烤煙碳氮代謝的差異，發(fā)現(xiàn)海拔高度影響烏蒙煙區(qū)烤煙碳氮代謝水平，中海拔地區(qū)煙葉細胞發(fā)育更為合理，碳氮代謝協(xié)調(diào)性更好，化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)。金云峰［5］以煙草植株為材料，分析了溫度對煙草植株生長發(fā)育、光合生理生化特性、質(zhì)體色素代謝和多酚物質(zhì)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)高溫和低溫處理對煙草葉片的生長發(fā)育均有抑制作用，不同生長溫度對不同生育期的煙堿含量及基因表達均有不同程度的影響。孟霖［6］研究了光質(zhì)對烤煙葉片代謝物質(zhì)積累及煙苗發(fā)育的影響，確定不同波段光譜煙葉成熟后期的輻射量與煙葉化學(xué)成分有較強的相關(guān)性，生物堿在不同光質(zhì)處理間變化趨勢一致，紅光和黃光明顯促進了生物堿積累。Li等［3］利用基于LC-MS/MS 的煙葉代謝譜分析方法，從全局表征煙葉代謝組，對津巴布韋和中國的煙葉進行了對比，并找出了主要的差異代謝物。耿召良等［7］研究了貴州不同產(chǎn)區(qū)煙葉，考察了生態(tài)條件和品種因素對烤煙次生代謝產(chǎn)物如生物堿、有機酸類、多酚類和甾醇類物質(zhì)等含量的影響，結(jié)果表明，生態(tài)條件對煙葉次生代謝產(chǎn)物含量影響明顯，而品種因素對煙葉次生代謝產(chǎn)物影響較小。對云南、貴州和河南3地?zé)熑~中代謝物的分析結(jié)果也表明，地區(qū)差異是造成代謝物差異的主要因素，其重要性高于品種差異［8-11］。

根據(jù)“全國烤煙煙葉香型風(fēng)格區(qū)劃研究”項目的研究結(jié)果，按照香韻可將烤煙分為八大香型風(fēng)格區(qū)，分別為：西南高原生態(tài)區(qū)（Ⅰ區(qū)，清甜香型）、黔桂山地生態(tài)區(qū)（Ⅱ區(qū)，蜜甜香型）、武陵秦巴生態(tài)區(qū)（Ⅲ區(qū)，醇甜香型）、黃淮平原生態(tài)區(qū)（Ⅳ區(qū)，焦甜焦香型）、南嶺丘陵生態(tài)區(qū)（Ⅴ區(qū)，焦甜醇甜香型）、武夷丘陵生態(tài)區(qū)（Ⅵ區(qū)，清甜蜜甜香型）、沂蒙丘陵生態(tài)區(qū)（Ⅶ區(qū)，蜜甜焦香型）、東北平原生態(tài)區(qū)（Ⅷ區(qū)，木香蜜甜香型）。目前，根據(jù)八大香型風(fēng)格區(qū)區(qū)劃分析生態(tài)因素對鮮煙葉代謝組影響的研究尚未見報道。為此，采集了八大香型風(fēng)格區(qū)典型煙葉產(chǎn)區(qū)的煙葉樣品，結(jié)合氣象數(shù)據(jù)，對煙葉中的質(zhì)體色素、生物堿、有機酸、游離氨基酸、萜類化合物和甾醇類化合物進行了靶向分析，同時分別使用基于LC-MS和GC-MS的煙葉非靶向檢測方法對煙草代謝組進行了測定［12］，分析了八大香型風(fēng)格區(qū)中鮮煙葉代謝物與不同氣象因子的相關(guān)性，旨在了解煙草各類代謝物（脂類化合物、含氮化合物、糖類化合物、有機酸類化合物、核酸類化合物和甾醇類化合物）的生態(tài)成因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

根據(jù)八大香型風(fēng)格區(qū)劃選擇典型產(chǎn)區(qū)，于2013年至2015 年間進行樣品采集（表1 和表2）。樣品為成熟期第10葉位鮮煙葉，相鄰的3株煙葉合并為1個樣品，每個地點每個品種設(shè)6個生物學(xué)重復(fù)。樣品采集后立即液氮冷凍，之后在-70 ℃條件下進行運輸和儲藏。

表1 2013、2014年度新鮮煙葉樣品來源Tab.1 Sources of fresh tobacco leaf samples in 2013 and 2014

表2 2015年度新鮮煙葉樣品來源Tab.2 Sources of fresh tobacco leaf samples in 2015

1.2 代謝組學(xué)檢測方法

于鮮煙葉樣品獲取當(dāng)年采集代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，采集方法參照文獻［12］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過搜索數(shù)據(jù)庫（自建數(shù)據(jù)庫、METLIN、NIST等）、標(biāo)準品比對等定性方法，共鑒定出500余種煙草代謝產(chǎn)物，經(jīng)過數(shù)據(jù)的標(biāo)準化（非靶向方法采用內(nèi)標(biāo)校正）和歸一化（UV、Par、Z-score 等）處理后，使用Simca 13.0 軟件進行主成分（PCA）分析和正交偏最小二乘（OPLS）判別分析，獲取不同香型風(fēng)格區(qū)之間的差異代謝物；計算Pearson 相關(guān)系數(shù)，考察香型風(fēng)格區(qū)生態(tài)特征與該區(qū)特征代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系；使用MetaboAnalyst 3.0進行代謝途徑富集分析。

1.4 香型風(fēng)格相關(guān)代謝物的篩選

按照香型風(fēng)格區(qū)對烤前鮮煙葉樣品進行分組，采用正交偏最小二乘回歸（OPLS），根據(jù)所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進行判別分析（OPLS-DA），成功建立了基于OPLS的判別分析模型（該模型的可靠性判別指標(biāo)R2和Q2均大于0.8）。基于OPLS-DA模型對分組的貢獻大小（VIP 值）對代謝物進行排序。一般認為VIP值大于1的代謝物為不同組間的差異代謝物，對分組的貢獻較大。經(jīng)分析，共獲得116種與香型風(fēng)格區(qū)劃相關(guān)的代謝物，這些代謝物分別屬于脂類物質(zhì)（52 種）、生物堿（4 種）、多酚（3 種）、有機酸（15 種）、氨基酸（9 種）、甾醇（2 種）、糖類物質(zhì)（9 種）和其他（22種，包括核酸和維生素等）。

1.5 生態(tài)及氣象數(shù)據(jù)的采集

查閱當(dāng)年氣象局官方網(wǎng)站獲取的氣象數(shù)據(jù)，以大田生育期日均溫度（T）、移栽伸根期溫度（T1）、旺長期溫度（T2）、成熟前期溫度（T3）、成熟中后期溫度（T4）、成熟后期溫度（T5）、平均晝夜溫差（T-delta）、生育期平均日照時數(shù)（S）、移栽伸根期日照時數(shù)（S1）、旺長期日照時數(shù)（S2）、成熟前期日照時數(shù)（S3）、成熟中后期日照時數(shù)（S4）、成熟后期日照時數(shù)（S5）、總?cè)照諘r數(shù)/移栽后至采收的生長周期（S-percent）、生育期平均降雨量（R）、移栽伸根期降

雨量（R1）、旺長期降雨量（R2）、成熟前期降雨量（R3）、成熟中后期降雨量（R4）、成熟后期降雨量（R5）等氣象數(shù)據(jù)和與香型風(fēng)格相關(guān)的116種代謝物進行Pearson相關(guān)分析。

1.6 不同香型風(fēng)格煙葉代謝特征形成的生態(tài)成因分析

對各生長期的溫度、日照時數(shù)、降雨量等與香型風(fēng)格相關(guān)的116 種代謝物進行Pearson 相關(guān)分析，判斷八大香型風(fēng)格區(qū)的鮮煙葉代謝特征形成的生態(tài)成因。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同香型風(fēng)格煙葉代謝特征的生態(tài)成因分析

香型風(fēng)格相關(guān)的116 種代謝物與各香型風(fēng)格區(qū)生態(tài)條件的相關(guān)性如圖1～圖5所示，整體來看，代謝物積累與溫度、日照時數(shù)、降雨量等存在顯著的相關(guān)關(guān)系，溫度和日照時數(shù)對代謝物積累的影響多為正相關(guān)，而降雨量的影響則相反，多為負相關(guān)。

2.2 溫度、日照時數(shù)、降雨量對脂類積累的影響

由圖1和圖2可見，降雨量不利于脂類物質(zhì)的積累，大部分脂類代謝物與降雨量負相關(guān)，尤其是大田后期的降雨量（成熟中后期R4、成熟后期R5）不利于脂類物質(zhì)的積累，且相對于溫度和日照時數(shù)，降雨量對磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、甘油三酯（TG）的影響更弱，其相關(guān)性較小；溫度尤其是大田生長中后期（旺長期T2 至成熟中后期T4）的溫度與甾醇脂、鞘糖脂以及大部分的雙半乳糖甘油二酯（DGDG）、半乳糖基甘油二酯（MGDG）、PC 和PE 的含量正相關(guān)，即這一階段溫度高則有利于這些脂類物質(zhì)的積累；而TG的積累則正好相反，大部分TG的積累都與這一生長階段的溫度負相關(guān)，平均晝夜溫差對脂類物質(zhì)積累的影響較小。日照時數(shù)對脂類物質(zhì)積累的影響與溫度類似，不同的是生長后期日照時數(shù)（S5）仍對脂類物質(zhì)積累有較大的影響，S5 與鮮煙葉中脂類代謝物的相關(guān)性較高。Li等［9］基于河南、貴州和云南3個產(chǎn)地成熟期鮮煙葉脂質(zhì)組的研究表明，脂類代謝物的積累受氣候因素的影響較大，尤其以旺長期和成熟期溫度的影響最大，其次為成熟期日照時數(shù)和降雨量，該結(jié)論與本文中的研究結(jié)果一致。

圖1 溫度、日照時數(shù)、降雨量等與DGDG等脂類物質(zhì)的相關(guān)分析圖Fig.1 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and different lipids such as DGDGs

圖2 溫度、日照時數(shù)、降雨量等與PC、PE等脂類物質(zhì)的相關(guān)分析圖Fig.2 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and different lipids such as PC and PE

2.3 溫度、日照時數(shù)、降雨量對氨基酸、多胺、生物堿等含氮化合物的影響

由圖3 可見，溫度、日照時數(shù)等對谷氨酸（Glutamic acid）、天（門）冬氨酸（Aspartic acid）、5-羥脯氨酸（5-oxoproline）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、磷酸乙醇胺（Ethanolamine phosphate）表現(xiàn)出較強的負相關(guān)，與其他含氮化合物則具有較弱的正相關(guān)；上述5種化合物與大田生長前期溫度（T1、T2、T3）和日照時數(shù)（S1、S2、S3）的相關(guān)性較高，這一時期溫度較高或日照時數(shù)較長，不利于這些化合物的積累；降雨量在成熟后期（R5）對含氮化合物積累的影響較大，這一時期降雨量較多有利于上述5種化合物的積累，但不利于亞精胺（Spermidine）的積累。上述結(jié)果與Zhao等［10-11］對谷氨酸、天冬氨酸、5-羥脯氨酸的研究結(jié)果一致，與苯丙氨酸的研究結(jié)果則相反，這可能是由分析樣本的年度差異或苯丙氨酸對氣候響應(yīng)較為復(fù)雜等因素造成的。

圖3 溫度、日照時數(shù)、降雨量等與含氮化合物的相關(guān)分析圖Fig.3 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and nitrogenous compounds

2.4 溫度、日照時數(shù)、降雨量對糖、有機酸等代謝物的影響

如圖4 所示，除赤蘚糖醇（Erythritol）、阿糖醇（Arabitol）、木糖醇（Xylitol）、熊果苷（Arbutin）和葡萄糖酸（Gluconic acid）外，其余代謝物與大田生長中前期（移栽伸根期至成熟前期）的溫度和日照時數(shù)負相關(guān)，而與這一時期的降雨量正相關(guān)。其中，赤蘚糖醇和阿糖醇與整個生育期的溫度和日照時數(shù)呈弱的正相關(guān)關(guān)系，與降雨量弱負相關(guān)，這與Zhao 等［10］的研究結(jié)果相似。移栽伸根期的降雨量、日照時數(shù)、溫度等對圖4所示代謝物積累的影響最大，其次是旺長期，而成熟前期的溫度、日照時數(shù)和降雨量影響則較小。成熟后期的溫度（T5）與大部分代謝物積累呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，而這一時期的日照時數(shù)對代謝物積累的影響較小，降雨量對部分代謝物，如半乳糖醇（Galacitinol）、甘油磷酸鹽（Glycerol 1-phosphate）和異檸檬酸（Isocitric acid）積累的影響較大，具有明顯的正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)大于0.84）。有機酸受光溫水調(diào)控較有規(guī)律，除葡萄糖酸（Gluconic acid）外，有機酸受大田生長中前期（移栽伸根期至成熟前期）溫度和日照時數(shù)的負調(diào)控，受大田生長后期溫度（T4 和T5）尤其是成熟后期溫度（T5）的正調(diào)控，降雨量在整個生育期都表現(xiàn)出對有機酸積累的正調(diào)控模式，兩者正相關(guān)，這與Zhao等［10］的研究結(jié)果一致。

圖4 溫度、日照時數(shù)、降雨量等與糖、有機酸等的相關(guān)分析圖Fig.4 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and sugars，organic acids，etc.

2.5 溫度、日照時數(shù)、降雨量對核酸、甾醇等代謝物積累的影響

如圖5 所示，大田生長中后期（成熟中后期、成熟后期）尤其是成熟后期的降雨量（R5）對代謝物的影響較大，其他時期的降雨量對核酸、甾醇等代謝物的影響較小，其相關(guān)系數(shù)較小，相關(guān)性較弱；日照時數(shù)尤其是大田生長中前期的日照時數(shù)（S1、S2、S3）與代謝物積累的相關(guān)度較高，且多為負相關(guān)，僅有核糖酸-γ-內(nèi)酯（Ribonic acid-gamma-lactone 2）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、2,3-辛二酮（2，3-Octanedione）與日照時數(shù)正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.6）；溫度對代謝物積累的影響呈現(xiàn)兩段化，即生長中前期（T1、T2、T3）與成熟后期（T5）對代謝物積累的影響正好相反。除上述3 種代謝物外，有6 種代謝物與大田生長中前期的溫度（T1、T2、T3）具有較強的負相關(guān)關(guān)系。Zhao 等［10］的研究中中分析過核糖酸-γ-內(nèi)酯與光、溫、水的相關(guān)性，其結(jié)果與本研究中的結(jié)果一致，即與溫度、日照時數(shù)正相關(guān)，與降雨量負相關(guān)。

3 結(jié)論

每個風(fēng)格區(qū)劃鮮煙葉的特征代謝物均與生態(tài)條件有一定的相關(guān)性，溫度、日照時數(shù)、降雨量等生態(tài)特征參數(shù)的變化可以解釋大部分特征代謝產(chǎn)物積累量的高低，表明鮮煙葉的代謝特征與環(huán)境生態(tài)條件緊密相關(guān)。其中與代謝物含量有較高相關(guān)性的氣候因子為大田中后期溫度和大田中后期日照時數(shù)。除此之外，降雨不利于脂類物質(zhì)的積累，大田生產(chǎn)中后期溫度較高則有利于一些脂類物質(zhì)的積累。大田生長前期溫度較高或日照較長不利于多數(shù)含氮化合物的積累，而成熟后期的降雨則有利于多數(shù)含氮化合物的積累，但不利于亞腈胺（Spermidine）的積累。除葡萄糖酸（Gluconic acid）外，有機酸受大田生長中前期溫度和光照的負調(diào)控，受大田生長后期溫度尤其是成熟后期溫度的正調(diào)控，降雨量在整個生育期都表現(xiàn)出對有機酸積累的正調(diào)控模式。大田生長中后期尤其是成熟后期的降雨量對核酸甾醇等代謝物的影響較大，其他時期的降雨量則影響較小，而大田生長中前期的日照時數(shù)與核酸甾醇的積累多為負相關(guān)。