反相二維液相色譜法測定不同煙草制品煙草和煙氣中煙堿異構(gòu)體比值

朱瑞芝，司曉喜，王 凱，蔣 薇，楊 繼，向能軍，徐艷群，李 浪，劉志華，何 沛*

1. 云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號 650231

2. 安捷倫科技（中國）有限公司，北京市朝陽區(qū)望京北路3 號 100102

加熱卷煙通過加熱煙草而非燃燒煙草產(chǎn)生主流煙氣。和傳統(tǒng)卷煙相比，加熱卷煙無燃燒行為發(fā)生，減少了煙草高溫燃燒過程裂解產(chǎn)生的有害成分，且側(cè)流煙氣和環(huán)境煙氣的釋放量也明顯降低［1-5］。對于加熱卷煙和傳統(tǒng)卷煙2種不同的主流煙氣產(chǎn)生方式，文獻(xiàn)報(bào)道多集中于其主流煙氣粒徑分布的差異［6］、關(guān)鍵成分釋放量的差異［7-9］等方面，但對于在主流煙氣中R-（+）-煙堿和S-（-）-煙堿兩種異構(gòu)體釋放量比值（R/S）的差異性則鮮有報(bào)道。煙堿是煙草和煙氣中含量最豐富的生物堿，是煙草最重要的生理性活性成分，煙堿分子中含有一個(gè)手性中心，有2個(gè)代謝機(jī)理和生理特性完全不同的異構(gòu)體［10-12］：S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿，煙草中的煙堿主要以S-（-）-煙堿存在，S-（-）-煙堿占煙堿總量的99%以上［13］。目前煙堿手性分離分析方法主要有氣相色譜（GC）及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［13-16］、高效液相色譜法（HPLC）［17］、毛細(xì)管電泳法［18］、核磁共振法（NMR）［19-20］、電子圓二色譜法［21］、合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［22］等。由于煙草中煙堿兩種異構(gòu)體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異極大，且煙草和煙氣基質(zhì)復(fù)雜，不利于煙堿異構(gòu)體的分離和準(zhǔn)確測定，通常的方法均需要復(fù)雜的前處理以減少基質(zhì)的干擾。因此，本研究中采用中心切割-反相二維液相色譜法對煙草加熱和燃燒狀態(tài)下煙堿異構(gòu)體的R/S進(jìn)行研究，旨在揭示煙堿異構(gòu)體在加熱和燃燒2種狀態(tài)下R/S的差異，并為吸煙與健康研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

傳統(tǒng)卷煙、部分加熱卷煙；云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（簡稱云南中煙公司）出品加熱卷煙由云南中煙公司技術(shù)中心提供。樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；三乙胺、甲酸銨（AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；乙酸（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨、二乙胺（AR，廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司）；外消旋體煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，左旋煙堿［S-（-）-煙堿］和右旋煙堿［R-（+）-煙堿）標(biāo)準(zhǔn)品（＞99%，加拿大TRC公司）。

Agilent1260-Agilent1290二維液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Milli-Q-Intergral5 超純水儀（美國Millipore公司）；SHZ-88水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；BT125D 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 科學(xué)儀器有限公司）；KQ-700DB 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；具塞離心管（50 mL，德國Merck 公司）；一次性無菌注射器（5 mL，江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司）；有機(jī)相濾膜（0.22 μm，上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品分析

1.2.1.1 煙氣中煙堿異構(gòu)體分析

取傳統(tǒng)卷煙、加熱卷煙（未經(jīng)平衡），按加拿大深度抽吸模式［21］（加熱卷煙固定抽吸8口，未進(jìn)行通風(fēng)阻塞）抽吸3支卷煙樣品。將捕集主流煙氣的劍橋?yàn)V片置于30 mL 的甲醇中，超聲萃取40 min。取上清液，過有機(jī)相濾膜后，進(jìn)行中心切割-二維液相色譜分析。

空白試驗(yàn)：向離心管中加入空白劍橋?yàn)V片，加入30 mL甲醇溶液，與上述處理方式相同，進(jìn)行中心切割-二維液相色譜分析。

1.2.1.2 卷煙中煙堿異構(gòu)體分析

稱取0.2 g 煙草原料，置于30 mL 甲醇中，超聲萃取40 min。取上清液，過有機(jī)相濾膜后，進(jìn)行中心切割-二維液相色譜分析。

空白試驗(yàn)：離心管中不加煙草原料樣品，直接加入30 mL 甲醇溶液，與上述煙草原料樣品處理方式相同，進(jìn)行中心切割-二維液相色譜分析。

1.2.1.3 中心切割-二維液相色譜分析條件

一維液相色譜條件：

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；流速：1 mL/min；流動相A：50 mmol/L的乙酸銨溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件Tab.2 Gradient elution conditions

二維液相色譜條件：

Trap 柱：PoroShell EC-C18柱（4.6 mm×5 mm，4 μm）；手性色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相：V甲醇∶V乙腈=45∶55（甲醇為混合液：V甲醇∶V乙酸∶V三乙胺=100∶0.25∶0.05）；流速：1 mL/min；檢測波長：259 nm；柱溫箱溫度：25 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

檢測流程：一維色譜柱對進(jìn)樣樣品進(jìn)行富集凈化（圖1a），在3.8 min 切換閥位置（圖1b），將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至Trap 柱，在4.0 min 切換閥復(fù)原（圖1c）；二維流動相將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至二維色譜柱，二維色譜柱繼續(xù)對樣品進(jìn)行分離分析。系統(tǒng)流路連接見圖1。

圖1 二維液相色譜工作流路圖Fig.1 Flow charts of two-dimensional liquid phase chromatography

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent OpenLAB 數(shù)據(jù)分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲取回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 一維色譜柱的選擇

選擇合適的一維色譜柱，既能把煙堿以外的雜質(zhì)分離開，又有較好的保留。另外，需要有盡可能窄的色譜峰以利于獲得更短的閥切換時(shí)間窗口。在相同洗脫條件下，對PoroShell Bonus-RP、Poroshell HPH-C18、PoroShell PFP、 PoroShell EC-C8及PoroShell SB-C85種色譜柱進(jìn)行煙堿分離效果的比較，結(jié)果見圖2。可知，HPH-C18柱對煙堿的保留性能和峰形均較好。最終選用Poroshell HPH-C18色譜柱作為一維色譜柱分離和富集煙堿。

圖2 不同一維色譜柱對煙堿的分離效果Fig.2 Separation of nicotine by different one-dimensional chromatographic columns

2.2 Trap柱的選擇

傳統(tǒng)的中心切割二維液相色譜法采用大體積的定量環(huán)，收集并儲存第一維目標(biāo)組分，可能會造成第二維色譜柱嚴(yán)重過載，導(dǎo)致色譜峰變形、展寬等；也會出現(xiàn)切割體積超過樣品環(huán)體積的情況，造成色譜峰丟失，從而影響準(zhǔn)確定量［24］。本研究中采用Trap柱進(jìn)行捕集，選用與一維色譜柱同型號的PoroShell HPH-C18Trap柱時(shí)，Trap柱的保留性不夠，導(dǎo)致煙堿捕集不完全。最終選用PoroShell EC-C18Trap柱，能夠達(dá)到很好的保留。

2.3 二維液相色譜條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)煙堿異構(gòu)體的手性分離，考察不同色譜柱及分離模式對煙堿異構(gòu)體的分離效果，選擇與反相色譜的流動相兼容的手性柱，對色譜條件以及流動相的比例、添加劑的種類和濃度進(jìn)行優(yōu)化。先后考察了 Agilent Chiral-T、Chiral-V、Chiral-CD 以及Daicel IA-3、IC-3共5種手性色譜柱，在反向色譜模式（Reverse phase chromatography，RP）下，選用合適的流動相及洗脫條件，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Agilent Chiral-T 柱對2 種煙堿異構(gòu)體的分離度較好。由于煙堿是二元弱堿，在水溶液中以游離態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)存在，因此，用流動相洗脫時(shí)容易出現(xiàn)煙堿峰拖尾的現(xiàn)象［25］。在本研究中，通過加入一定量的添加劑改善煙堿分離效果。酸性添加劑選用乙酸和甲酸，在同樣條件下，乙酸的分離效果更好；在含適量乙酸的流動相中分別加入二乙胺、三乙胺和乙酸銨進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)添加三乙胺的分離效果較好，二乙胺和乙酸銨相對乙酸的體系均表現(xiàn)較差。在流動相中添加乙酸-三乙胺的緩沖體系，具有重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度和靈敏度高的特點(diǎn)，達(dá)到了改善峰寬和減少拖尾的效果。通過色譜條件的優(yōu)化，分離度達(dá)到1.9以上，如圖3所示。

圖3 二維色譜柱的選擇Fig.3 Selection of two-dimensional chromatographic columns

2.4 二維液相色譜圖

圖4、圖5分別為外消旋煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和典型卷煙煙氣樣品色譜圖。可知，一維色譜圖中1.0～10.0 min 為樣品中的雜質(zhì)峰，3.8～4.0 min 時(shí)，目標(biāo)煙堿被精準(zhǔn)切割，進(jìn)入二維液相色譜，并在12.0 min～15.0 min出峰，S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿的基線分離較好，并且質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的R-（+）-煙堿不受基質(zhì)干擾。表明樣品中目標(biāo)物在一維色譜圖中得到很好的富集和凈化分離，消除了基質(zhì)干擾；在二維色譜圖中，S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿得到較好的基線分離。可見采用中心切割-二維液相色譜有效解決了煙草復(fù)雜基質(zhì)干擾問題，操作簡單，穩(wěn)定性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，分析時(shí)間短，適用于復(fù)雜基質(zhì)中煙堿異構(gòu)體的分離及定量測試。

圖4 外消旋煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of standard solution of racemic nicotine

圖5 典型卷煙煙氣樣品色譜圖Fig.5 Chromatograms of typical cigarette smoke sample

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、回收率及檢測限

對每個(gè)物質(zhì)的最低濃度對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定10 次，以測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍為方法的檢出限，使用煙草原料加標(biāo)法和空白濾片加標(biāo)法在低、中、高3 個(gè)濃度水平上測定回收率，結(jié)果見表3。S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿的相關(guān)性良好，煙草原料加標(biāo)回收率在92.6%～105.8%之間，濾片加標(biāo)回收率在89.1%～104.5%之間，方法的檢出限在0.076～0.100 mg/L之間，表明本方法測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表3 方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和檢出限Tab.3 Regression equations, linear correlation coefficients, recoveries and LODs of the method

2.6 方法的精密度

選取典型的煙草樣品和卷煙樣品，分別按照1.2節(jié)中方法對煙草和煙氣樣品進(jìn)行5次平行測試，考察方法的精密度，結(jié)果如表4 所示。煙草樣品S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿的RSD在0.52%～1.51%之間，煙氣樣品S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿的RSD在0.81%～2.61%之間，表明該方法的精密度良好。

表4 方法的精密度（n=5）Tab.4 Precisions of the method（n=5）

2.7 不同類型卷煙樣品煙堿異構(gòu)體的R/S分析

2.7.1 傳統(tǒng)卷煙煙堿異構(gòu)體的R/S

幾種代表性傳統(tǒng)卷煙樣品煙草和主流煙氣中煙堿異構(gòu)體的R/S分析結(jié)果如表5所示。可知，不同品牌傳統(tǒng)卷煙中，煙草中煙堿異構(gòu)體的R/S約在0.16%～0.35%之間，主流煙氣中煙堿異構(gòu)體的R/S 約在1.44%～1.65%之間，主流煙氣中煙堿異構(gòu)體的R/S約是煙草中的4.05～9.71倍，可能原因是部分S-（-）-煙堿異構(gòu)體在燃燒過程中發(fā)生消旋化所致［13］。

表5 傳統(tǒng)卷煙煙堿異構(gòu)體的R/STab.5 R/S ratios of nicotine isomers in conventional cigarette

2.7.2 加熱卷煙煙堿異構(gòu)體的R/S

幾種代表性加熱卷煙樣品中煙草和主流煙氣中煙堿異構(gòu)體的R/S分析結(jié)果如表6所示。可知，中心加熱卷煙煙草中煙堿異構(gòu)體的R/S 約在0.09%～0.32%之間，顯著大于周向加熱卷煙，可能是由于兩種類型加熱卷煙配方的差異性導(dǎo)致。中心加熱卷煙主流煙氣中的R/S 是煙草中的1.65～2.00 倍，可能原因是中心加熱卷煙工作溫度一般在350～400 ℃之間，在加熱過程中S-（-）-煙堿發(fā)生少量消旋化轉(zhuǎn)化為R-（+）-煙堿，因此中心加熱卷煙主流煙氣中的R/S稍高于煙草。周向加熱卷煙主流煙氣中的R/S未能得到數(shù)據(jù)。兩種類型加熱卷煙主流煙氣中的R/S存在顯著差異的主要原因是煙草原料中煙堿原質(zhì)量分?jǐn)?shù)和加熱溫度的差異，一方面周向加熱卷煙煙草原料中R-（+）-煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低；另一方面，低溫下煙堿的整體轉(zhuǎn)移率低，而低于250 ℃時(shí)，S-（-）-煙堿的消旋化不明顯，導(dǎo)致捕集到的R-（+）-煙堿低于方法定量限。

2.7.3 傳統(tǒng)卷煙與加熱卷煙煙堿異構(gòu)體R/S的比較

由表5、表6 可知，傳統(tǒng)卷煙與加熱卷煙煙堿異構(gòu)體中R/S 的差異較大。傳統(tǒng)卷煙煙草中煙堿異構(gòu)體的R/S與中心加熱卷煙差異不大，可能與傳統(tǒng)卷煙和中心加熱卷煙在配方結(jié)構(gòu)上較為一致有關(guān)；而傳統(tǒng)卷煙主流煙氣中煙堿異構(gòu)體的R/S 顯著高于加熱卷煙，造成這種差異的主要原因是S-（-）-煙堿的熱消旋化［13］。由于目前市售加熱卷煙的加熱溫度一般不超過400 ℃，而傳統(tǒng)卷煙燃燒溫度在600 ℃以上［26］，部分S-（-）-煙堿受熱消旋轉(zhuǎn)化為R-（+）-煙堿，因此，與煙草中相比，傳統(tǒng)卷煙主流煙氣中的R/S 增加明顯。

表6 加熱卷煙煙堿異構(gòu)體的R/STab.6 R/S ratios of nicotine isomers in heated tobacco products

3 結(jié)論

（1）建立了基于Trap柱捕獲-中心切割的反相二維液相色譜法并分離分析卷煙煙草和煙氣中的S-（-）-煙堿和R-（+）-煙堿異構(gòu)體，該方法有效解決了煙草復(fù)雜基質(zhì)的干擾問題，適用于復(fù)雜基質(zhì)中煙堿異構(gòu)體的分離及定量測試。

（2）傳統(tǒng)卷煙煙草中R-（+）-與S-（-）-煙堿異構(gòu)體的比值（R/S）約在0.16%～0.35%之間，中心加熱卷煙煙草中的R/S約在0.09%～0.32%之間，這兩類卷煙煙草中的R/S 基本相當(dāng)，而周向加熱卷煙煙草中的R/S明顯低于傳統(tǒng)卷煙和中心加熱卷煙。

（3）傳統(tǒng)卷煙主流煙氣中的R/S顯著高于加熱卷煙；而中心加熱卷煙主流煙氣中的R/S高于周向加熱卷煙，煙氣中的R/S與傳統(tǒng)卷煙和加熱卷煙的使用溫度有關(guān)。