基于DNA宏條形碼技術的藍彩帶蜂粉源植物多樣性研究

張 可,王林玲,黨曉群,李旭東,李 月,陸歡歡,牛澤清,袁 峰,朱朝東,黃敦元,*

1 重慶師范大學生命科學學院媒介昆蟲重點實驗室, 重慶 401331

2 中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室, 北京 100101

昆蟲授粉是一種重要的生態交互作用,不僅涉及超過80%的被子植物繁殖還參與約75%的農作物生產過程[1—3]。近年來由于農業擴張、傳粉昆蟲棲息地的喪失和破碎、殺蟲劑和除草劑的使用、微生物病原體感染等原因,傳粉者數量呈大幅降低趨勢[4—6]。膜翅目蜜蜂總科作為生態系統重要的傳粉類群,主要依靠植物的花粉和花蜜作為食物來源,其中花蜜主要提供碳水化合物,花粉主要提供蛋白質和脂質[7],因此,蜜蜂在特定植物上采食花粉和花蜜以滿足自身營養需求的同時幫助這些植物實現了授粉功能[8—11]。研究表明粉源植物是生態系統中重要的組成部分,是蜜蜂等傳粉者賴以生存的物質基礎,它們的數量和質量會影響蜜蜂物種多樣性[12—13]。

野生蜜蜂與家養蜜蜂是相對而言的,野生蜜蜂具有種類多、分布廣、適應性強等特性,諸多研究表明：特定生態系統中,野生蜜蜂提供的授粉服務功能是家養蜜蜂無法取代的,如在蘋果、藍莓、覆盆子、油茶等經濟作物的授粉中,野生蜜蜂扮演非常重要的角色[14—18]。Angelella[19]等人對美國中大西洋東岸和弗吉尼亞海灘地區21個農場的開花植物系統研究表明,家養蜜蜂和野生蜜蜂之間存在粉源植物資源的競爭。該競爭不僅會抑制野生蜜蜂的數量,而且會降低植物的座果率和結實率。尤其在開花植物資源有限的情況下,這會增加家養蜜蜂和野生傳粉者之間的生態位重疊,并加劇對野生傳粉者種群的負面影響。

野生蜜蜂類群是野生植物和農作物的重要傳粉昆蟲,如壁蜂屬多數物種因具有易管理、低成本和高傳粉效率等特點,所以常作為人工放養野生蜜蜂被廣泛應用于蘋果、櫻桃、梨等果樹的授粉[20]；大分舌蜂(Colletesgigas)和油茶地蜂(Andrenacamellia)等野生蜜蜂是湖南、江西等南方地區油茶優勢傳粉昆蟲[21]；白斑切葉蜂(Megachilestrupigera)廣泛分布于中國南方地區,是野生植物及農林作物的重要傳粉昆蟲之一,它的主要粉源植物為黃荊和山牡荊,這對維持白斑切葉蜂種群的穩定具有重要作用[22]。野生蜜蜂的大部分服務和益處與食物、藥物和授粉等有關[23],但到目前為止對野生蜜蜂的研究多為形態學、線粒體基因、生活方式等方面,對粉源植物研究甚少,而野生蜜蜂群落的豐富度和多樣性與授粉有關[24],因此,了解野生蜜蜂的主要粉源植物的種類組成及其分布情況對促進它們的種群繁衍有著重要意義。

DNA宏條形碼技術是利用高通量測序手段快速獲取混合樣本中所有物種的混合條形碼擴增序列,并通過生物信息學分析手段來鑒定混合樣本中物種組成及相對豐度的方法[25—26]。目前,該方法在植物研究方面常用的序列有：核基因 ITS/ITS2片段、葉綠體基因MatK、psbA-trnH、rbcL、trnL等以及不同序列組合[27]。相比傳統的蜂蜜孢粉學(Melissopalynology),DNA宏條形碼技術在花粉鑒定方面具有鑒定速度快、分類分辨率高等優勢[27—29]。Jones[30]等人使用DNA宏條形碼技術鑒定來自英格蘭和威爾士441個意大利蜜蜂蜂蜜樣本中的植物類群,將2017年與1952年(蜂蜜孢粉學)的樣本植物類群進行比較,推斷出蜜蜂主要覓食植物的變化是由植物在景觀中的可用性變化所驅動的,同時也證明了DNA宏條形碼技術相比顯微鑒定技術具有更高的植物分類分辨率。

藍彩帶蜂(NomiachalybeataSmith)屬隧蜂科(Halictidae)彩帶蜂屬(Nomia),廣泛分布于安徽、山東、江西、福建、廣西等我國東部地區,以及日本、韓國、印度、緬甸等國家[31—32]。該蜂是一種典型的廣訪花性(Polylectic)野生蜜蜂,主要在腐木及土中筑巢,巢室為一到多叢[33]。本研究基于藍彩帶蜂在國內的主要分布區,在我國東部18個不同樣地該蜂巢穴中獲取20份藍彩帶蜂蜂糧樣本,利用DNA宏條形碼技術研究該蜂粉源植物的多樣性,為全面掌握該蜂的粉源植物及保護策略提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

根據藍彩帶蜂成蟲活動期,于2020年6月至8月在我國東部地區9個省份共采集18個樣地20份藍彩帶蜂的蜂糧樣品(在江西省吉安市的井岡山市和青原區分別于6月和8月進行1次樣品采集)(表1,附圖1)。由于藍彩帶蜂的獨棲性,因此同一樣地的藍彩帶蜂蜂糧采取混合多個巢穴內蜂糧樣本至1—2g,置于2mL無菌離心管內密封保存,每個樣品為3個重復,所有樣品帶回實驗室后-20℃留存并用于后續實驗。

表1 藍彩帶蜂蜂糧樣本采集信息Table 1 Collection information of bee bread samples of Nomia chalybeata

附表1 不同樣地粉藍彩帶蜂源植物Shannon-wiener指數差異分析表Attached Table 1 Analysis of Shannon-wiener index differences of pollen plants of Nomia chalybeata in different areas

1.2 DNA提取

將混合樣本加入液氮充分研磨后,使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)按照試劑盒說明書進行DNA抽提,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 PCR擴增和測序

對花粉核基因組的ITS2區基因序列進行擴增,使用引物ITSS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′。PCR反應體系為20 μL,其中：2 μL DNA模板(5 ng/μL),4 μL FastPfu Buffer (5×),2.5 μL dNTPs (2.5mmol/L),上下游引物各0.8 μL (5 μmol/L),0.4 μL FastPfu Polymerase,添加ddH2O至20 μL。PCR反應條件：95℃ 預變性5 min；95℃變性30s,55℃ 退火30s,72℃ 延伸45s,共29個循環；72℃延伸10 min；12℃保存。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.)將其純化。純化后產物送至上海凌恩生物科技有限公司基于Illumina MiSeq平臺進行雙端測序(2×250 bp)。

1.4 數據處理

1.4.1數據質控與優化

測序原始數據使用Trimmomatic[34]過濾read尾部低質量堿基(Q<20)；利用FLASH v1.2.11[35]對短片段進行拼接(重疊區長度≥10bp,重疊區錯配率≤0.2),根據引物方向校正拼接序列方向；用Usearch v10.0(http://drive5.com/uparse/)去除嵌合體[36]。最終得到每個樣本的有效序列并用于后續類別注釋。

1.4.2OTU聚類及注釋

使用Usearch v10.0(http://drive5.com/uparse/)軟件按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行可操作性分類單元(OTU)聚類,得到OTU的代表序列[36]?；赨nite v8.2 (http://unite.ut.ee/index.php)數據庫采用RDP classifier v2.2貝葉斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/)對OTU代表序列進行物種分類注釋分析[37]。由于引物具有通用性,注釋為真菌的OTU序列在本研究中被舍棄,同時刪除樣本測序中小于10的序列物種。

1.4.3分析數據

數據處理在Excel 2016軟件進行統計,運用R軟件計算ACE指數、Shannon指數,利用SPSS 22.0進行單因素方差分析及多重比較,利用Origin 2019b進行柱狀圖繪制?；贠TU利用R軟件計算各樣本Bray-Curtis距離并采用factoextra包進行層次聚類(Hierarchical clustering)繪圖。利用R軟件vegan包利用非度量多維尺度法(NMDS)對聚類進行Beta多樣性分析,進一步進行相似性分析(ANOSIM)檢驗組間是否存在顯著差異。

2 結果

2.1 藍彩帶蜂蜂糧測序數據及物種注釋

本研究中共獲得2 722 294條有效序列,平均長度為(338.5±5.6) bp,序列按照97%的相似水平進行聚類獲得491個OTUs。采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行物種分類分析,注釋結果為47科,99屬,124種粉源植物(表2)。

表2 藍彩帶蜂蜂糧測序基本信息Table 2 Basic information about bee bread sequencing of Nomia chalybeata

2.2 藍彩帶蜂粉源植物種類及相對豐度

基于ITS擴增子獲得的分類結果,獲得藍彩帶蜂蜂糧樣本粉源植物共47科99屬124種,統計分析粉源植物物種組成和相對豐度(圖1)。在屬分類階元上,粉源植物相對豐度較高的屬為牡荊屬(Vitex)、紫金牛屬 (Ardisia)、懸鉤子屬(Rubus)、耳草屬(Hedyotis)、破布葉屬(Microcos)、柏拉木屬(Blastus)、稻屬(Oryza)、鳳仙花屬(Impatiens)、銀蓮花屬(Anemone)、珍珠菜屬(Lysimachia)等,所占比例分別為43.47%、17.07%、8.35%、5.50%、5.00%、4.03%、2.83%、2.21%、2.12%、1.73%。在種分類階元上,粉源植物主要包括黃荊(Vitexnegundo)、羅傘樹(Ardisiaquinquegona)、山莓(Rubuscorchorifolius)、疏花耳草(Hedyotismatthewii)、破布葉(Microcospaniculata)、少花柏拉木(Blastuspauciflorus)、野生稻(Oryzarufipogon)、野棉花(Anemonevitifolia)、水金鳳(Impatiensnoli-tangere)、藜狀珍珠菜(Lysimachiachenopodioides)等,所占比例分別為43.46%、17.06%、8.35%、5.50%、5.00%、4.03%、2.83%、2.12%、2.09%、1.57%。

圖1 藍彩帶蜂粉源植物在屬、種水平的組成及相對豐度Fig.1 Composition and relative abundance of pollen plants of Nomia chalybeata at genus and species level

附圖1 藍彩帶蜂雄性、雌性蜂及樣品采集Attached Fig.1 Male and female of Nomia chalybeata and sample collectionA 雄性藍彩帶蜂；B雌性藍彩帶蜂 ；C 藍彩帶蜂的卵；D 藍彩帶蜂的幼蟲及蜂糧；E 藍彩帶蜂的巢穴

2.3 藍彩帶蜂粉源植物多樣性分析

基于OTU水平進行Alpha多樣性指數分析,利用ACE指數、Shannon指數來反映粉源植物物種豐富度及多樣性。CQWS 、GXHP、SDLL的ACE指數(分別為4.69±0.40、4.61±0.54、4.44±0.46)較高,FJSM的ACE指數(2.72±0.11)最低(圖2)。JXGX、SDLL的Shannon指數(分別為3.52±0.09、2.39±0.07)較高,FJSM的Shannon指數(0.33±0.02)最低,不同樣地間具有顯著差異(附表1,圖2)。綜上,SDLL樣地的豐富度和多樣性最高,FJSM樣地的豐富度和多樣性最低。

圖2 藍彩帶蜂粉源植物的Alpha多樣性指數Fig.2 Alpha diversity of indices of pollen plants of Nomia chalybeata 圖中數據為平均值±標準差；Shannon指數圖中未標注顯著性差異,Shannon指數顯著性差異見附表1

2.4 藍彩帶蜂粉源植物層次聚類及結構差異

不同樣地藍彩帶蜂粉源植物種類及相對豐度不同,基于此對不同樣地藍彩帶蜂粉源植物進行層次聚類分析,采用Bray-curtis距離計算各樣本間距離。當類距離為27時,聚類結果可分為七類(圖3),其中第一聚類(A聚類,下同)共10個樣地分別為AHGZ、AHJZ、FJSM、GXHP、GXLZ、HNCS、HNHY、HNQY、HNWC、ZJCS；第二聚類(B聚類)共5個樣地分別為JXJG6、JXJG8、JXQY6、JXQY8、JXYZ；剩余樣地各為一個聚類。各聚類的優勢種都不同,A聚類優勢種是黃荊,B聚類優勢種是羅傘樹,C聚類(JXGX)優勢種是疏花耳草,D聚類(CQWS)優勢種是野棉花,E聚類(CQSMS)優勢種是山莓,F聚類(HNLS)優勢種是破布葉,G聚類(SDLL)優勢種是野生稻。

圖3 藍彩帶蜂粉源植物層次聚類圖Fig.3 Hierarchical cluatering of pollen plants of N. chalybeata

利用非度量多維尺度法(NMDS)對A聚類進行Beta多樣性分析結果顯示十個樣地距離都不遠,進一步對A聚類的組間距離進行相似性分析,結果顯示A聚類兩兩對比不存在顯著差異(P>0.05)。對B聚類進行Beta多樣性分析,結果顯示B聚類五個樣地相聚很近(圖4),對B聚類的組間距離進行相似性分析,結果顯示B聚類粉源植物結構兩兩對比不存在顯著差異(P>0.05)。其中相同地點不同時期的JXJG6和JXJG8粉源植物結構不存在顯著差異(R2= 1,P=0.1)；JXQY6和JXQY8粉源植物結構也不存在顯著差異(R2= 0.593,P=0.1)。因此在6月和8月兩個時期藍彩帶蜂的粉源植物結構無顯著差異。

圖4 利用非度量多維尺度法(NMDS)對藍彩帶蜂粉源植物A、B聚類進行Beta多樣性分析Fig.4 The Beta diversity of A and B cluster of pollen plants of Nomia chalybeata analyzed by Non-metric multidimensional scaling (NMDS) Nomia chalybeata

3 討論

目前DNA宏條形碼作為一種新型鑒定手段在蜂蜜溯源、昆蟲-植物傳粉網絡、水生態等研究領域中應用廣泛[38—40]。對于植物鑒定而言,基于通用引物的可得性、高水平的分類分辨率,生命條形碼聯盟推薦rbcL和matK的質體DNA (ptDNA)基因區作為標準DNA條形碼標記[41]。因為它們是植物核心DNA條形碼之一,而且一些國家對本地植物區系建立了相應的rbcLDNA條形碼參考庫,可大大提升對物種的鑒別能力[42]。ITS2作為條形碼序列是基于通用引物保守區域的可用性、擴增的方便性以及足夠的可變性,甚至可以區分密切相關的物種[43—45]。近年來在植物類群的定性分析方面,Richardson[46]等人利用蜂蜜孢粉學和ITS2 metabarcoding對美國俄亥俄州麥迪遜縣蜂群采集的花粉進行鑒定,結果顯示ITS2 metabarcoding鑒定到19個植物科,蜂蜜孢粉學僅鑒定到8個科,ITS2序列具有更高的靈敏度和分類分辨率,而且對于花粉的定量分析,使用ITS2 metabarcoding和蜂蜜孢粉學共同鑒定優于單獨的方法。本研究雖未利用蜂蜜孢粉學進行對比,但研究結果與文獻記載基本吻合,進一步補充藍彩帶蜂等野生蜜蜂粉源植物DNA宏條形碼技術研究方面的空白。

本研究在數據處理方面對樣本數據進行一個閾值設置：去除每個樣本最大計數數小于10的序列,這是由于DNA宏條形碼會產生假陽性結果[47—48]。假陽性通常是由于污染、嵌合序列和/或生物信息學管道的錯誤識別驅動的、缺少條形碼空白或樣品的稀缺性等原因造成,因此尤其是在瀕危物種和入侵物種的監測中,物種的誤判對生態系統的影響是非常嚴重的[40],DNA宏條形碼在鑒定物種方面仍需與傳統鑒定方法(蜂蜜孢粉學)相結合才能更精確、快速的鑒定物種。

基于OTU水平,對不同樣地的ACE指數、Shannon指數進行分析發現不同地區的Alpha多樣性是有差異的,這可能是因為藍彩帶蜂的棲息地周圍粉源植物不同造成物種豐富度和多樣性均有一定程度差異。在山東省臨沂市蘭陵縣采集的蜂糧顯示此地藍彩帶蜂粉源植物的物種豐富度和多樣性最高,物種豐富度和多樣性最低的是福建省三明市胡訪鎮采集的蜂糧。在江西省吉安市井岡山市和江西省吉安市青原區的兩次采集樣品(JXJG6、JXJG8、JXQY6、JXQY8)的ACE指數、Shannon指數均無差異,Beta多樣性分析結果也顯示距離很近,且結構兩兩對比不存在顯著差異,因此在6月和8月兩個時期藍彩帶蜂的粉源植物多樣性和結構無顯著差異。六月這兩個樣地主要粉源植物羅傘樹的相對豐度分別為79.7%和74.9%,而八月相對豐度分別為52.8%和67.3%,表明該蜂成蟲活動期主要粉源植物變化不大,優勢粉源植物羅傘樹花期約為五月,果期約十一月[49],從六月至八月的主要粉源植物花期過時,藍彩帶蜂逐漸開始利用其他粉源植物。

早期研究者根據中國科學院館藏各地送檢標本的信息總結藍彩帶蜂到訪植物主要有：黃荊、草木犀(Melilotusofficinalis)、醉魚草屬(Buddleja)、水柳(Homonoiariparia)、紫苜蓿(Medicagosativa)、槐(Styphnolobiumjaponicum)、益母草(Leonurusjaponicus)、菊科(Compositae)等[31]。本研究鑒定到的粉源植物中黃荊、草木犀、菊科、醉魚草屬、紫苜蓿、槐均有包含；益母草未被檢測,但是本研究中檢測到與益母草同屬的細葉益母草(Leonurussibiricus)及假鬃尾草(Leonuruschaituroides),可能是送檢標本采集地有益母草物種分布而沒有同屬細葉益母草和假鬃尾草的分布,也有可能形態學鑒定有誤；水柳在本研究中也未被檢測,水柳花期一般為3至5月[50],而藍彩帶蜂成蟲活動期為6至8月[31],所以標本采集者在水柳上采集到的只是棲息狀態下的藍彩帶蜂。

Biesmeijer[51]等人在英國及荷蘭境內的調查表明：蜜蜂和蜜(粉)源植物的多樣性呈下降趨勢,并對當地的經濟作物和野生物種產生不利影響。在群落范圍內植物-傳粉者相互作用對維持生物多樣性十分重要[52],且粉源植物和傳粉昆蟲二者間具有密切關聯;鄧惠等[53]的研究發現：忍冬屬的4種植物花色發生變化則傳粉者的訪花頻率隨之改變,花變色的特性、范圍差異會導致該物種由不同種類的傳粉昆蟲進行授粉,這是開花植物與昆蟲長期相互適應并共同進化的結果;Goulnik等[54]對2017—2019年關于植物-傳粉者互作網絡等關鍵詞的文章進行分析發現土地利用集約化可能會導致花色的改變、花蜜管平均深度的降低以及花粉質量的降低,花的性狀可能與傳粉者匹配性狀的改變有關,傳粉者與其傳粉植物間有著十分的密切關系。因此調查研究藍彩帶蜂的主要粉源植物對于維持生物多樣性具有重要作用,為研究野生蜜蜂-植物間的相互作用奠定基礎。