SAFB通過調節Wnt信號通路活性促進結直腸癌增殖

焦紅麗，王珺嬈，胡敏萱，黃 元，丁彥青，冶亞平

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，病死率較高是導致患者死亡的主要癌癥之一[1]。近年來，全球范圍內結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡逐漸年輕化[2-3]。支架附著因子B(scaffold attachment factor-B, SAFB)屬于核蛋白家族成員，其通過直接或者間接與基因啟動子相結合，抑制相關基因轉錄，同時也是穩定基因組3D結構的重要因素[4]，在人體組織中廣泛表達。本課題組前期實驗結果顯示，SAFB與結直腸癌的演進密切相關[5]，SAFB低表達可通過SAFB-TAK1-NF-κB信號軸發揮抑制結直腸癌演進的功能，但SAFB是否在結直腸癌的發生，尤其是增殖過程中發揮作用，以及發揮作用的具體分子機制尚不完全清楚。本課題組利用多種體內外實驗結合公共數據庫分析，著重探討SAFB對結直腸癌細胞增殖能力的影響，并探討可能的分子機制，以深化對結直腸癌發生與演進機制的系統化研究，并為臨床結直腸癌的診斷與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集南方醫科大學南方醫院存檔的結直腸癌石蠟標本175例和手術切除的新鮮配對結直腸癌樣本50對，配對樣本包括腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織。所有標本均經病理檢查確診為結直腸癌，所有患者均未接受放、化療。

1.2 細胞及試劑人結直腸癌細胞株HCT116、SW620、SW480和HCT15,均購自美國ATCC模式生物庫；慢病毒包裝質粒購自上海吉凱公司；逆轉錄病毒表達載體pSUPER-retro-puro、慢病毒表達載體psin-EF2-puro及雙熒光素酶報告基因質粒為課題組自存。SAFB抗體購自美國Abcam公司；通用型SP試劑盒(SP-9000)、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；RT-PCR主要試劑：Trizol購自Invitrogen公司，SYBR GREEN MIX購自日本TOYOBO公司，逆轉錄試劑盒購自日本TAKARA公司；0.25%胰酶、胎牛血清、DMEM、RPMI-1640培養基、無酚紅DMEM培養基，均購自美國Gibco公司。

1.3 雙熒光素酶報告基因實驗細胞鋪板，待細胞長至60%左右匯合度時洗去含血清的培養基，加入預先配好的轉染液，37 ℃培養6 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養基，轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，分析信號通路活性情況。

1.4 穩定細胞株的構建磷酸鈣法制備慢病毒、逆轉錄病毒，建立SAFB過表達、干擾穩定細胞株，將含有重組質粒SAFB/psin-EF2-puro、SAFB shRNA1、SAFB shRNA2及陰性對照質粒psin-EF2-puro、pSUPER-retro-puro、慢病毒包裝質粒及逆轉錄包裝質粒的轉染液加入產病毒細胞293FT中轉染，轉染結束24～48 h后，用含1 μg/mL嘌呤霉素的培養基篩選出轉染成功陽性細胞克隆，擴大培養，并收集以上細胞株的RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blot法進行鑒定。

1.5 裸鼠皮下成瘤實驗細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，無血清培養基洗3遍，調整細胞濃度為每毫升1×107個；1 mL注射器吸取細胞液用于裸鼠皮下注射接種，每只裸鼠注射200 μL細胞液(每只約2×106個細胞)，每組6只；隔天用游標卡尺測量1次腫瘤體積，腫瘤體積計算公式為體積=長度×寬度×高度/2；處死裸鼠并分離腫瘤組織后，置于10%中性福爾馬林中固定，24 h后進行蠟塊制作，切片，行HE及免疫組化染色。

1.6 統計學分析采用SPSS 20.0 軟件進行數據學分析，采用One-way ANOVA檢驗分析MTT、平板克隆實驗結果數據，檢驗時需要進行Levene方差齊性檢驗，若方差齊，采用Fisher方差分析進行整體比較，采用LSD-t檢驗進行組間多重比較，采用Dunnett法進行多個處理組和一個對照組的比較；若方差不齊，則采用近似F檢驗Welch法分析進行整體比較，采用DunnettT3檢驗進行組間多重比較。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達Oncomine(http://www.oncomine.com)及TCGA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)檢測結果顯示，結直腸癌組織中SAFB的表達水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，且其表達量隨著臨床分期的增加呈下降趨勢(P<0.01，圖1A)。基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)結果顯示，在SAFB低表達組中出現結腸癌相關基因的顯著富集(P<0.001，圖1B)。RT-PCR檢測結果顯示，結直腸癌組織中SAFB mRNA表達水平均低于癌旁正常黏膜組織(圖1C)。

圖1 SAFB在結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中的表達水平：A.TCGA數據庫中SAFB表達與結直腸癌臨床分期的關系；B.GSEA分析SAFB表達下調后結直腸癌相關基因富集情況；C.RT-PCR定量分析結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB mRNA的表達

2.2 不同分期結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達免疫組化檢測結果顯示，SAFB表達主要定位于細胞核，呈棕紅色或黃褐色。SAFB蛋白在結直腸癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，并且隨著Dukes分期的升高，SAFB的表達水平明顯下降(表1，圖2)。

圖2 不同分期結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達，SP法

表1 SAFB表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 體內、體外過表達SAFB對結直腸癌細胞增殖能力的影響MTT實驗、平板克隆實驗表明，SAFB過表達可抑制HCT116和SW620細胞的增殖能力(圖3)。裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示，SAFB過表達明顯抑制腫瘤細胞的生長速度(P<0.01，圖4A、B)；免疫組化結果顯示，SAFB過表達組腫瘤細胞的Ki-67增殖指數明顯低于對照組(圖4C)。流式細胞檢測結果顯示，SAFB過表達促進腫瘤細胞的凋亡(圖5)。以上體內、體外實驗結果證明，SAFB通過促進細胞的凋亡抑制腫瘤的生長和增殖。

圖3 過表達SAFB對體外結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.MTT實驗；B.平板克隆形成實驗

圖4 過表達SAFB對體內結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下瘤；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數

圖5 過表達SAFB對細胞凋亡的影響

2.4 體內外干擾SAFB表達對結直腸細胞增殖的影響MTT實驗、平板克隆及裸鼠皮下成瘤實驗均顯示，干擾內源性SAFB表達促進腫瘤細胞的增殖能力(圖6、7)。流式細胞檢測結果顯示，SAFB過表達促進腫瘤細胞的凋亡(圖8)。以上體內外實驗結果證明，SAFB低表達通過抑制細胞的凋亡促進腫瘤的生長和增殖。

圖6 干擾SAFB表達對體外結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.MTT實驗；B.平板克隆形成實驗

圖7 干擾SAFB表達對體內結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下成瘤大體圖；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數

圖8 干擾SAFB表達對細胞凋亡的影響

2.5 公共數據庫分析SAFB相關信號通路GSEA分析結果顯示，在SAFB低表達組中均出現Wnt信號通路相關基因的顯著富集(圖9)。

圖9 GSEA分析SAFB表達下調后相關基因富集情況

2.6 SAFB下調對Wnt信號通路的影響雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與對照組相比，干擾SAFB表達后Wnt熒光素酶活性升高(P<0.001，圖10A)。Western blot結果顯示，干擾SAFB表達后，Wnt信號通路下游關鍵基因Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達明顯上調，而p21、p27表達明顯下調。相反，過表達SAFB后Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達明顯下調，p21、p27表達明顯上調(圖10B)。免疫熒光染色結果顯示，干擾SW480細胞中SAFB表達后，β-catenin入核明顯增加(圖10C)。以上實驗結果證明，SAFB下調后可激活Wnt信號通路。

圖10 SAFB表達下調對Wnt信號通路的影響：A.雙熒光素酶報告基因實驗；B.Western blot法分析Wnt信號通路下游相關基因表達；C.免疫熒光顯示β-catenin入核情況

3 討論

結直腸癌的發生與演進是一個多因素、多步驟的復雜網絡調控系統，其常常伴有癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調節基因和DNA修復基因的改變等。SAFB是一種在人體組織中廣泛表達的核蛋白家族成員，作為一種核基質結合因子，通過N端DNA結合域(SAP/SAF-BOX)和C-端的轉錄抑制結構直接或者間接與基因啟動子相結合，抑制相關基因轉錄[4]。目前已知SAFB相關的生物學功能主要有：Xist調控的X染色體失活(Xist是X染色體失活的重要lncRNA)、細胞凋亡、DNA損傷反應、細胞應激反應、細胞增殖、RNA轉錄和加工[4,6-7]等。有研究表明，SAFB的基因改變與乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發生、演進及預后密切相關。SAFB通過抑制雌激素受體α(estrogen receptor alpha, ERα)和雄激素受體(androgen receptor, AR)的表達和活性，對乳腺癌和前列腺癌的發生、發展起重要的抑制作用[8-9]。

本課題組前期實驗結果顯示，SAFB可以通過直接靶向TAK1抑制NF-κB信號通路的活性，從而抑制結直腸癌的侵襲和轉移，同時，實驗也發現，SAFB高表達后不僅抑制腫瘤的侵襲能力，同時也顯著抑制腫瘤的生長[5]。SAFB抑制腫瘤生長的具體機制、是否與NF-κB信號通路相關及是否有其他相關的分子機制參與的問題，需要我們開展后續的研究深入探究。

通過公共數據庫預測并進一步擴大樣本量檢測，實驗發現SAFB在結直腸癌中的表達顯著低于正常黏膜組織，且表達水平與腫瘤分期和分化等臨床病理特征密切相關，說明其很可能是結直腸癌發生與演進的重要預后標志物。此外，大量的體內外實驗證實，SAFB可以明顯抑制腫瘤的增殖能力，促進其凋亡，但具體機制仍需深入探究。

Wnt/β-catenin信號能夠控制發育、維持干性以及通過調節細胞增殖與分化決定影響成體組織的穩態平衡，該信號通路發生失調與多種腫瘤密切相關[10-11]。90%以上的結直腸癌患者攜帶Wnt信號途徑的體細胞突變，如APC腫瘤抑制基因失活等[12]，導致Wnt信號通路的持續性激活。本課題組通過前期生物信息學預測結合雙熒光素酶報告基因實驗和Wnt信號通路關鍵蛋白的表達等證實SAFB下調激活Wnt信號通路。免疫熒光檢測結果顯示SAFB下調可以促進β-catenin入核，表明SAFB低表達可以通過增強Wnt通路活性影響結直腸癌的發生、發展。結合本組前期實驗結果，作者認為在結直腸癌中SAFB低表達可以顯著影響NF-κB及Wnt等重要腫瘤相關信號通路的活性，NF-κB及Wnt信號通路也可能通過“交叉對話”的方式共同影響腫瘤發生與演進。同時，鑒于SAFB的重要功能，我們可以嘗試通過改變細胞內SAFB表達水平或結合相應受體來調控相關信號通路，最終達到腫瘤控制與治療的目的。

長期以來，抑制RAS的膜結合被認為是一種合理的抗癌治療方法，因此可以通過應用法尼基轉移酶抑制劑進行抗癌治療。最近有研究表明，SAFB通過控制FNTA(由兩種異戊二烯基轉移酶共享的亞基)表達促進RAS膜結合。沉默SAFB來降低FNTA的水平，從而使KRAS和NRAS突變細胞對FTI抑制劑更敏感[13]，這為我們的研究工作提供了新的思路，當結直腸癌中SAFB表達降低時，應用FTI進行抗癌治療有望顯著提高治療效果。最近，一項關于黑色素瘤的相關研究表明，腫瘤細胞通過分泌大量的β-catenin阻止T細胞浸潤到腫瘤微環境中，從而減弱臨床免疫治療的效果[14]。在結直腸癌的聯合免疫治療中，我們可以嘗試通過調節SAFB的表達來改善晚期結直腸癌患者的腫瘤免疫微環境，以期提高聯合免疫治療的效果。

綜上所述，SAFB在結直腸癌組織中低表達，SAFB可能通過影響Wnt及NF-κB信號通路活性來影響結直腸癌細胞增殖與侵襲能力，這使得SAFB成為結直腸癌治療研究中的新目標。深入認識SAFB在結直腸癌發生、發展中的作用，充分了解其作用機制，可以為結直腸癌早期診斷及治療提供新思路。