食管鱗狀細胞癌癌變過程中HPV16/18 E6蛋白與PIK3CA、PIK3CB突變的相關性及其臨床意義

溫菲菲，李揚揚，何 雙，許曉陽，崔忠澤，路麗禎，吳淑華

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤[1]，患者生存率低[2]，預后差。目前認為絕大多數食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)來自鱗狀上皮異型增生的惡變，即正常上皮→低級別異型增生(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)→高級別異型增生(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)→ESCC，其中由LGIN和HGIN演變為浸潤癌的相對危險度分別為9.8和28.3[3-4]。病毒感染與腫瘤的發生密切相關，已有研究發現HPV感染與食管癌的發生密切相關[5]。HPV16和HPV18型病毒作為HPV中最常見的類型，主要通過抑制抑癌基因的功能促使細胞癌變[6]。HPV16/18 E6蛋白作為HPV感染后的早期癌蛋白，在HPV感染后病毒復制和細胞惡變的過程中發揮重要作用[7-8]。Ilahi等[9]采用免疫組化法檢測HPV16/18 E6蛋白的表達并應用PCR檢測HPV16、18的一致性高達85%。HPV16/18 E6蛋白能夠準確反映HPV16、18病毒在體內的活性狀態。本課題前期實驗發現，在食管癌中PIK3CA、PIK3CB呈高表達[10]。然而，食管癌中HPV感染與PIK3CA、PIK3CB突變的相關性及其對食管癌發生、發展和預后的影響尚缺乏深入研究。本實驗采用免疫組化法檢測HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管正常黏膜、LGIN、HGIN及ESCC中的表達情況，探討HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管癌癌變過程中所發揮的作用，為進一步分析食管癌的發生、發展機制和靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2020年12月濱州醫學院附屬醫院病理科存檔的胃鏡下黏膜下剝離術(endoscopic dissection, ESD)切除食管LGIN 35例，HGIN 34例。收集2009年1月～2011年12月手術切除的ESCC 137例，正常食管黏膜(距腫瘤旁≥5 cm)32例。根據WHO(2019)消化系統腫瘤分類標準[11]，所選病例切片由兩位資深病理專家重新閱片，所有病例均為首次發現，術前均未行放、化療。

1.2 試劑鼠抗人PIK3CA(克隆號ab5453)和PIK3CB(克隆號ab5559)抗體均購自Abcam公司；鼠抗人HPV16/18 E6(克隆號C1P5)抗體購自Santa Cruz公司；p53(克隆號DO-7)抗體、通用型二抗及DAB顯色液均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化EnVision法染色：將切片脫蠟、水化，3%H2O2孵育30 min，高壓熱修復抗原，加一抗PIK3CA(1 ∶150)、PIK3CB(1 ∶250)、HPV16/18 E6(1 ∶200)、p53(即用型工作液)4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為空白對照，用已知HPV16/18 E6陽性的子宮頸癌組織切片、已知p53陽性的子宮漿液性癌組織切片、已知PIK3CA蛋白陽性的腦組織切片、已知PI3KCB蛋白陽性的扁桃體組織切片作為陽性對照。

1.3.2結果判斷 HPV16/18 E6、p53陽性主要位于腫瘤細胞胞核，PIK3CA、PIK3CB陽性主要位于腫瘤細胞胞質。采用雙盲法在每張切片上隨機觀察10個高倍視野(400×)。每視野計數100個腫瘤細胞，根據細胞染色強度和陽性細胞比例評判實驗結果。按胞質或胞核發現淡黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞標志。染色強度：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分(染色深淺與背景著色相對比)；陽性細胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；將兩項得分相乘作為最終分數。對于PIK3CA、PIK3CB、HPV16/18 E6蛋白的評分≤4分為陰性，>4分為陽性；對于p53，當評分為2～8分時p53的判定為陰性，當評分為0～1或9～12分時p53判定為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，不同分組間蛋白的表達差異及各蛋白表達與臨床病理因素之間的關系采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，Log-rank法比較統計學差異，Cox回歸模型確立影響預后的獨立因素；不同分組間蛋白之間的表達相關性采用Spearman相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC癌變過程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表達HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組及ESCC組中呈不同程度的陽性(表1，圖1～4)。HPV16/18 E6蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組的陽性率分別為0、8.6%、26.5%、29.9%；統計分析結果顯示，HPV16/18 E6蛋白在ESCC組與HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組和LGIN組，差異均有統計學意義(P均<0.05)，LGIN組與食管正常黏膜組、HGIN組與ESCC組相比，蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。p53蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組中的陽性率分別為9.4%、28.6%、50.0%、68.6%；統計分析顯示，p53蛋白在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組和LGIN組，差異均有統計學意義(P<0.05)，p53蛋白在HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組，差異有統計學意義(P<0.05)，食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組與ESCC組相比，蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。PIK3CA蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組和ESCC組中的陽性率分別為9.4%、17.1%、26.5%、25.5%；統計分析顯示，PIK3CA蛋白在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組，ESCC組與LGIN組、HGIN組，兩兩相比，蛋白表達差異無統計學意義(P均>0.05)。PIK3CB蛋白在食管正常黏膜組、LGIN組、HGIN組、ESCC組的陽性率分別為6.3%、14.3%、23.5%、21.9%；統計分析顯示，PIK3CB在ESCC組中的表達高于食管正常黏膜組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而食管正常黏膜組與LGIN組、HGIN組，ESCC組與LGIN組、HGIN組，兩兩相比，蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 食管鱗狀細胞癌癌變過程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表達差異

圖1 A.HPV16/18 E6在正常黏膜中呈陰性；B.HPV16/18 E6在食管低級別異型增生部分細胞核中呈陽性；C.HPV16/18 E6在食管高級別異型增生細胞核中呈陽性；D.HPV16/18 E6在食管鱗狀細胞癌細胞核中呈陽性，EnVision法 圖2 A.p53在正常黏膜中呈陰性；B.p53在食管低級別異型增生部分細胞核中呈陽性；C.p53在食管高級別異型增生細胞核中呈陽性；D.p53在食管鱗狀細胞癌細胞核中呈陽性，EnVision法 圖3 A.PIK3CA在正常黏膜中呈陰性；B.PIK3CA在食管低級別異型增生細胞質中呈弱陽性；C.PIK3CA在食管高級別異型增生細胞質中呈陽性；D.PIK3CA在食管鱗狀細胞癌細胞質中呈陽性，EnVision法 圖4 A.PIK3CB在正常黏膜中呈陰性；B.PIK3CB在食管低級別異型增生細胞質中呈弱陽性；C.PIK3CB在食管高級別異型增生細胞質中呈中等陽性；D.PIK3CB在食管鱗狀細胞癌細胞質中呈強陽性，EnVision法

2.2 ESCC中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表達與臨床病理特征的關系HPV16/18 E6蛋白在ESCC中的表達與腫瘤發病部位、分化程度、淋巴結轉移具有相關性，其中在頸段與上段、分化程度高、無淋巴結轉移的腫瘤中，HPV16/18 E6蛋白呈高表達，差異有統計學意義(P<0.05)。p53與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移有相關性，在浸潤深度深、有淋巴結轉移的食管癌中，其呈高表達，差異有統計學意義(P<0.05)。PIK3CA、PIK3CB表達與腫瘤淋巴結轉移有相關性，在有淋巴結轉移的ESCC中，兩者呈高表達，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關性

2.3 ESCC癌變過程中HPV16/18 E6與p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關性HPV16/18 E6與p53在ESCC組中的表達呈正相關(r=0.202，P=0.018)，在LGIN、HGIN組中無明顯相關性(P>0.05)。HPV 16/18 E6與PIK3CA在HGIN組、ESCC組中的表達均呈正相關(r=0.368，P=0.021；r=0.198，P=0.018)，在LGIN組中無明顯相關性(P>0.05)。HPV16/18 E6與PIK3CB在LGIN組、HGIN組、ESCC組中的表達均無明顯相關性(P>0.05，表3)。

表3 食管不同病變組織中HPV16/18 E6與p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關性

2.4 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表達與ESCC患者預后的關系137例ESCC患者中位生存時間為44個月，5年生存率為28.5%。HPV16/18 E6蛋白陽性與陰性患者的5年生存率分別為46.3%、20.8%(圖5)；p53蛋白陽性與陰性患者的5年生存率分別為23.4%、39.5%；PIK3CA陽性與陰性患者的5年生存率分別為17.1%、32.4%。Kaplan-Meier分析結果顯示，與ESCC預后相關的因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴結轉移(P<0.05，圖5)。Cox多因素生存分析結果顯示，影響ESCC患者預后的獨立因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴結轉移，而患者年齡、性別、腫瘤體積、腫瘤分化程度、PIK3CB均非ESCC患者預后的獨立因素(表4)。

圖5 食管鱗狀細胞癌患者Kaplan-Meier生存曲線：A.HPV16/18 E6蛋白表達與患者預后的關系；B.p53蛋白表達與患者預后的關系；C.PIK3CA蛋白表達與患者預后的關系；D.淋巴結轉移與患者預后的關系

表4 食管鱗狀細胞癌患者預后多因素生存分析

3 討論

食管癌的發病率位居全球惡性腫瘤的第8位[12-13]。食管癌有多種組織病理學類型，其中90%為ESCC。ESCC的治療方案主要是手術切除后輔以放、化療，但晚期ESCC患者的預后仍然較差[14]。因此，迫切需要闡明食管癌的發病機制，尋找有效的靶向分子以預警食管癌的發生。

病毒感染與多數腫瘤的發生密切相關，如EB病毒與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的發生有關。研究證實，HPV是多發性惡性腫瘤發生、發展的危險因素[15-17]。1982年Syrjanen[18]最早提出食管癌的發生可能與HPV感染有關。研究顯示，HPV16、18感染是食管癌發生、發展的高危因素[19]。本實驗發現，隨著食管癌的發生、發展，即由正常食管組織→LGIN→HGIN→ESCC的過程中，HPV16/18 E6蛋白陽性率逐漸增高，表明在ESCC的進展過程中HPV16、18感染可能通過某種途徑促進ESCC的發生。研究表明[6, 20]，HPV16/18 E6蛋白可與細胞內E6相關蛋白(E6-AP)形成復合物，特異性結合p53，抑制p53的抑癌作用，p53基因會發生失活或突變，通過促進下游靶基因的轉錄，誘導細胞停滯在G1期，使得癌細胞的增殖/凋亡比例失衡，致使ESCC進一步惡化。本實驗結果亦顯示，p53蛋白在ESCC組中的突變率高于食管正常黏膜組和LGIN組，在HGIN組中的表達高于食管正常黏膜組，且p53突變與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移密切相關。同時，在ESCC組中，HPV16/18 E6蛋白與p53突變呈正相關，而在LGIN、HGIN組中無明顯相關性。作者認為，HPV16/18 E6蛋白在食管鱗狀上皮異型增生階段，可能并非通過激活p53通路，而是通過其他途徑完成。在ESCC中，HPV16/18的持續感染通過非特異性激活p53通路，導致p53失活或突變，進而促進腫瘤的浸潤和轉移。

HPV的持續感染可導致多種信號通路異常激活[21-22]。其中，HPV感染可引起PI3K/Akt信號通路中多種細胞因子的異常激活，進而促進腫瘤的發生、發展[23]。Marquard等[24]研究發現，頭頸部鱗狀細胞癌中PI3K/Akt信號通路的異常激活與HPV感染密切相關，且與患者不良預后相關。Beaty等[25]研究發現PIK3CA突變與HPV相關的口咽鱗狀細胞癌的化療后無瘤生存期有關。Madera等[26]認為抑制PIK3CA表達和HPV感染可抑制口腔鱗狀細胞癌的生長。本實驗結果顯示，PIK3CA、PIK3CB蛋白在ESCC組的表達高于食管正常黏膜組；并且PIK3CA、PIK3CB表達與ESCC淋巴結轉移有關。作者認為，PIK3CA蛋白高表達可激活PI3K/Akt信號傳導通路，使細胞快速生長，并失去分化成熟能力，同時，該通路的異常激活可能在促進血管形成、腫瘤上皮-間質轉化及侵襲、轉移中發揮作用。同時，在HGIN及ESCC組中，HPV16/18 E6蛋白表達均與PIK3CA呈正相關。作者推測，在食管HGIN向ESCC進展過程中，HPV的持續感染導致HPV16/18 E6蛋白表達上調，誘導腫瘤中PIK3CA突變，進而激活PI3K/Akt信號通路，誘導腫瘤的發生發展、侵襲及轉移。因此，臨床內鏡篩查食管疾病時，可通過檢測HPV感染并靶向治療HPV感染，可能會減緩或阻止ESCC的發生、發展。

影響ESCC預后的因素眾多。本組通過Kaplan-Meier生存分析結果表明，HPV16/18 E6、p53、PIK3CA及淋巴結轉移均與ESCC患者預后密切相關。Cox多因素生存分析顯示，HPV16/18 E6是提示ESCC良好預后的獨立因素；p53、PIK3CA及淋巴結轉移是ESCC預后的獨立危險因素。作者認為，發生于食管頸段及胸上段、分化程度較高及無淋巴結轉移的ESCC患者中，HPV16/18 E6蛋白陽性率更高，其可能是由于HPV16/18 E6蛋白過表達誘導的ESCC發生部位較高，患者自發癥狀較早，可早期獲得治療有關；而其誘導的腫瘤分化程度較高，且無淋巴結轉移，也可能是HPV16/18 E6蛋白陽性患者預后較好的潛在原因。同時，HPV16/18 E6蛋白高表達可導致p53和pRB的失活或突變，促進基因組重排[27]，而DNA重排患者對放、化療更敏感，使得HPV16/18 E6陽性腫瘤患者的生存率更高。

綜上所述，在ESCC癌變過程中存在HPV16/18 E6蛋白、p53和PIK3CA、PIK3CB蛋白高表達，并且HPV感染與PIK3CA突變密切相關。因此，聯合檢測HPV16/18 E6蛋白和PIK3CA突變對ESCC的預后判斷和優化治療具有重要意義。然而，本實驗僅對HPV16/18 E6蛋白和p53、PIK3CA、PIK3CB表達的相關性及其臨床意義進行初步探討，還需增加樣本量進一步分析，并深入開展細胞、分子機制的分析，為臨床靶向藥物的選擇提供可靠依據。