p21調控胃癌POLD1基因的初步機制探究

阮細玲，黃幼生，翁 陽，楊 丞，陳孟柚，胡嘉影，徐 恒

胃癌發病率位居全球惡性腫瘤的第5位，位居國內惡性腫瘤的第3位[1]。近年來針對胃癌的免疫治療、新輔助治療等方法取得一定的療效，但晚期胃癌患者的病死率仍較高。目前，作用于特定靶點的小分子靶向藥物因其藥物不良反應較輕、耐藥率低、患者服用方便等優點成為晚期胃癌患者的新治療手段之一[2]，小分子靶向藥物依據作用機制分為抑制腫瘤血管增生和抑制腫瘤細胞增殖兩類[3]。

DNA聚合酶δ(polymerase deta, Polδ)是惟一與細胞周期相關且在DNA復制中起主導作用的DNA復制酶[3-4]，其催化亞基p125具有5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶兩種活性，編碼該亞基的基因稱為POLD1。Polδ的催化亞基p125催化活性的提高與其表達調控異常有關[5]。

作為細胞周期蛋白激酶抑制因子，p21在細胞周期進程的調控中發揮重要作用。我們推測其可能參與了對POLD1基因的調控，本文將探究其可能的調控模式。通過對p21調控胃癌POLD1基因表達初步機制的分析，以探索基于降低POLD1基因表達并阻斷癌細胞惡性增殖的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料胃癌細胞株MGC-803購自中國科學院上海生物細胞研究所；pXJ41-neo載體由新加坡國立大學王躍教授惠贈，pXJ41-p21i是將p21干擾質粒的cDNA構建入pXJ41-neo載體獲得的真核表達載體，由北京師范大學桑建利教授惠贈；DMEM培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；高效真核轉染試劑Vigofect購自威格拉斯生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技公司；兔抗人p21抗體C19、山羊抗人Polδ(p125)抗體C20為Santa Cruz產品；遠紅外熒光標記的山羊抗兔及兔抗山羊二抗為美國KPL公司產品。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析p21與POLD1蛋白-蛋白互作關系(protein-protein interaction, PPI) String(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)是已知和預測的蛋白質與蛋白質相互作用的在線數據庫，本實驗通過String探討p21與POLD1 PPI，構建關鍵的PPI網絡。隨后，利用生物信息學軟件Cytoscape 2.6對該PPI網絡進行了映射，構建了PPI模塊。

1.2.2穩定轉染p21干擾質粒 MGC-803細胞培養于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養基，轉染前1 h給細胞換用無血清DMEM培養基。質粒與轉染試劑Vigofect 5 μg ∶3 μL比例制備轉染復合物，15 min后均勻滴入培養板細胞，轉染后12 h便可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，轉染后24 h將細胞傳代轉種，用含200～400 μg/mL G418的DMEM培養基培養直至篩選出陽性克隆。將實驗分為3組：轉染p21干擾質粒pGPU6/GFP/neo-p21i的803-p21i細胞；轉染陰性對照質粒pGPU6/GFP/neo-shNC的陰性對照組803-NC細胞；未經轉染的胃癌MGC-803細胞為空白對照組803細胞。(1)熒光定量PCR實驗檢測相關細胞周期因子的mRNA相對水平。應用Primer premier 5.0軟件設計各基因的引物序列(表1)。Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，ABI 7500熒光定量PCR儀上進行反應，反應體系：9 μL PCR mix、9 μL去離子水、1 μL引物、1 μL cDNA。以GAPDH作為內參，PCR條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸31 s，合計40個循環，采用比較Ct法，7500 Software v 2.0.5分析數據。(2)Western blot法檢測相關細胞周期因子的蛋白表達水平。RIPA裂解液提取細胞總蛋白，測定濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min變性后上樣電泳。100 mA電流條件下轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗(p21、p125一抗稀釋比分別為1 ∶500、1 ∶2 000)過夜，PBST洗膜10 min×3次，室溫孵育二抗(稀釋比1 ∶5 000)1 h，PBST洗膜10 min×3次，PBS洗1次(10 min)，最后用LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描PVDF膜，Odyssey V 3.0軟件分析圖像及數據。

表1 熒光定量PCR實驗設計的引物序列

1.2.3免疫共沉淀實驗分析p21與p125的相互作用 (1)免疫細胞化學分析胃癌細胞MGC-803內p125、p21蛋白定位：胰酶消化MGC-803細胞后用蓋玻片制作細胞爬片，DMEM完全培養基中培養24 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定爬片30 min，然后用中性樹膠將爬片的背面粘在載玻片上，正面滴加PBS以防干燥，用0.3%Triton X-100通透10 min，PBS洗滌，以非免疫山羊血清室溫下封閉30 min，置3%H2O2水溶液中室溫15 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗滌3 min×3次。(2)免疫共沉淀實驗：用IP裂解緩沖液(用前加入蛋白酶抑制劑Cocktail)冰上裂解細胞30 min，12 000 r/min離心30 min后取上清，將蛋白濃度調整為1 μg/μL。將1 μg相應的抗體加入到細胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜。加入預處理的protein A/G-beads 4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h。免疫沉淀反應后，4 ℃、3 000 r/min離心3 min，棄上清，用protein A/G-beads裂解緩沖液洗3次，PBS洗滌3次。加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴8 min進行蛋白變性；12 000 r/min離心1 min，將上清轉移至新的EP管中。SDS-PAGE電泳后進行Western blot分析。

2 結果

2.1 生物信息學軟件分析p21與POLD1基因的關系生物信息學軟件Cytoscape、String分析結果顯示，p21與POLD1基因通過CDK2、PCNA而相互聯系(圖1)，亦與CDK4、CDK6、Cyclin E1、Cyclin D1、p53等細胞周期調控因子間接相關。

圖1 生物信息學軟件分析p21與POLD1基因之間的相互關系：A.p21(CDKN1A)與POLD1之間通過CDK2、PCNA相互聯系；B.p21(CDKN1A)對POLD1的調控與CDK4、CDK6、Cyclin E1、Cyclin D1、p53等細胞周期調控因子間接相關

2.2 穩定轉染p21干擾質粒轉染p21干擾質粒及陰性對照質粒12 h后便可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白發出的熒光(圖2)，表明轉染成功。

2.2.1相關細胞周期因子的mRNA表達水平 熒光定量PCR實驗結果顯示，與陰性對照組803-NC細胞、空白對照組803細胞相比，實驗組803-p21i細胞的p21 mRNA低表達，而POLD1 mRNA表達上調。其他相關因子中，p53 mRNA表達受到抑制，CDK4、CDK2、PCNA的mRNA表達上調，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 熒光定量PCR檢測p21低表達細胞的mRNA水平：實驗組803-p21i細胞的POLD1、CDK4、CDK2、PCNA mRNA表達上調，p53 mRNA表達受到抑制

2.2.2相關細胞周期因子的蛋白表達水平 Western blot法檢測結果顯示，實驗組803-p21i細胞的p125、CDK4、CDK2、PCNA蛋白表達水平均高于對照組803-NC細胞、803細胞，p53蛋白表達水平則低于對照組803-NC細胞、803細胞，這與各基因對應的mRNA相對表達水平的變化相一致(P均<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法檢測p21低表達細胞的相關蛋白表達

2.3 免疫共沉淀實驗分析p21與p125的相互作用

2.3.1免疫細胞化學 免疫細胞化學染色結果顯示，p125表達定位于胃癌MGC-803細胞胞核；p21蛋白表達定位于細胞質和細胞核(圖5)。

圖5 免疫細胞化學檢測p125、p21在胃癌細胞MGC-803中的表達：A.p125表達定位于細胞核；B.p21表達定位于細胞質；C.p21表達定位于細胞核，MaxVision法

2.3.2免疫共沉淀實驗 分別用p21及p125抗體沉淀MGC-803細胞中提取的總蛋白，獲得的沉淀物進行Western blot法檢測。用p21抗體沉淀時，沉淀物中檢測到p21蛋白，但未檢測到p125蛋白，反之用p125抗體沉淀時，檢測到p125蛋白，但未能檢測到p21蛋白，實驗重復3次，結果均一致。表明p21與p125并無蛋白質直接相互作用，或結合作用極弱未能被檢測出(圖6)。

圖6 免疫共沉淀實驗分析p21與p125的相互作用：圖左側為p125抗體沉淀總蛋白；圖右側為p21抗體沉淀總蛋白

3 討論

Polδ是真核生物DNA復制最重要的聚合酶之一，其由4個亞基組成，其中p125是其催化亞基，同時具有聚合酶和外切酶功能，p125的編碼基因為POLD1，其表達受到細胞周期的調控[3]。Northern blot實驗顯示，Polδ mRNA表達水平在G1/S期升高了3倍。用Western blot法檢測Polδ調控蛋白水平也顯示在G1/S期達到峰值，其變化與mRNA水平的變化相似[6]。本期前期實驗結果亦發現，POLD1在S期的啟動子活性高于G2期或G1期，且在S期早期最高，表明POLD1啟動子的活性受到細胞周期嚴格調控，在G1/S交界處發揮功能的周期相關蛋白可能對其活性調控尤為重要[7]。

p21是一種小分子量非結構化蛋白質，其可以通過與細胞周期蛋白依賴性激酶結合從而使其失活。有研究表明，S期p21的水平決定著DNA復制速度，以保持基因組的穩定性[8]。所以p21曾被認為是一種腫瘤抑制因子[9]，主要作用是抑制細胞周期進程，從而導致細胞生長抑制[10-13]。作者推測p21很可能參與了對POLD1的調控，并提出了兩種假設：(1)p21蛋白直接與POLD1編碼的蛋白質p125相互結合，從而影響Polδ聚合酶功能的發揮。(2)p21不與p125相互作用，而是通過影響其他細胞周期調控因子的表達從而間接地調控POLD1的表達。

本實驗采用免疫細胞化學法檢測發現p125主要定位于MGC-803細胞胞核內，這與p125在子宮頸癌及子宮頸上皮內病變組織中的亞細胞定位一致[14]。最近也有學者研究發現p125在子宮頸癌細胞株Hela中的表達定位可以在細胞核與細胞質之間來回穿梭[4]。p21蛋白既可定位于細胞質，也可定位于細胞核，定位于不同部位的p21可能發揮著不同的功能[15]。結合p21在胃癌細胞中的亞細胞定位結果，作者認為p21與p125蛋白間可能有直接相互作用。然而，本組的免疫共沉淀實驗并未檢測到p125蛋白與p21蛋白直接相互作用。提示胃癌細胞MGC-803內p21并未與p125直接結合，或者結合的量極其微弱，Western blot法未檢測及。據此作者認為p21與p125不是通過蛋白-蛋白相互作用的方式影響Polδ復制全酶的形成進而影響其DNA復制活性。

本實驗通過生物信息學數據庫String及軟件Cytoscape發現，p21與POLD1之間通過CDK2、PCNA而比較緊密地聯系起來，還與CDKs、Cyclin等細胞周期調控相關因子有關。

哺乳動物的細胞周期是由細胞周期蛋白及其相關的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復合物驅動的。細胞周期蛋白CDK的異常失調是癌癥的標志[16]。CDK4/6在細胞周期的早期具有關鍵作用，CDK2在細胞周期后期起作用，并具有相當廣泛的蛋白質底物，其中一些是正常細胞增殖所必需的[17]，據此我們推測CDKs可能參與了p21對POLD1基因的調控。

PCNA是一個與DNA復制、細胞周期、細胞凋亡等相關的蛋白質，目前已發現PCNA可以與Polδ的多個亞基相互結合，在Polδ催化亞基p125的N端存在和PCNA相互作用的保守區域-N2(N末端129-149位)，其含有一個PIP盒[18]。DNA復制時，PCNA與Polδ形成復制復合體，使前導鏈上連續的DNA復制繼續進行。而p21的N末端具有保守的CDK/Cyclin結合位點，C末端具有PCNA結合的位點，PCNA-p21復合物可以與多種CDK/Cyclin形成四聚體，使CDK活性被抑制[8]。

有研究表明，p53對G1期向S期的過渡非常關鍵，注射特異的p53單克隆抗體，會導致細胞不能由G1期進入S期[8]。Cyclin D-CDK4/6復合物在G1期與p21、p27相互作用，阻止CKI與Cyclin E/CDK2結合，從而阻斷G1期進程[19]。最近有研究用生物信息學分析發現了210個預期受p53-p21-DREAM-CDE/CHR途徑調控的靶基因，大多數是G2期和有絲分裂的重要調節因子，包括細胞周期基因B-MYB(MYBL2)、BUB1、CCNA2、CCNB1、POLD1和RAD54L等基因。Fischer等[20]認為p53阻滯G2/M細胞周期主要是通過p53-p21-DREAM-CDE/CHR途徑下調這些基因。

為探究p21是否通過這些相關的細胞周期調控因子來間接調控POLD1基因，本實驗建立p21低表達的胃癌細胞系，并檢測了POLD1、CDK2、PCNA的基因和蛋白表達水平，結果發現POLD1、CDK2、CDK4、PCNA的表達水平與p21呈負相關，而p53則與p21呈正相關。這表明細胞周期調控因子CDK2、CDK4、PCNA及p53均參與p21對POLD1的調控。另外，有研究者在POLD1啟動子中發現了4個潛在的CpG島，發現轉錄因子E2F1可與這些位點結合，其結合親和力隨年齡增大而衰減，表明E2F1在衰老過程中可通過結合POLD1啟動子而下調POLD1的表達[21]。那么p21是否通過E2F1而間接調控POLD1的表達仍需進一步探究。

總之，本實驗結果顯示，p21并非通過和p125蛋白-蛋白相互作用的模式調控POLD1基因，而是通過細胞周期調控因子CDK2、CDK4、PCNA、p53等間接調控POLD1基因的表達，更深入的調控機制有待后續實驗深入探究。