LDHA及LDHB對胃癌組織中免疫微環境的影響及臨床意義

聶佳琪，潘 鳳，李曉寧，崔海康，張旭東，楊 蘭，張文杰

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，每年全球新確診病例超過100萬[1]。能量代謝的重新編程和免疫逃避[2]是癌癥的兩個新興標志[3]。乳酸代謝中的關鍵酶——乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)常以LDHA和LDHB兩種不同的亞型存在，LDHA負責丙酮酸轉化為乳酸和NAD+，而LDHB負責將乳酸轉化為丙酮酸，促進氧化代謝[4]。在腫瘤細胞中，即使在氧氣充足的情況下，丙酮酸也易被LDHA催化成乳酸，稱為Warburg效應，也稱為有氧糖酵解[5]。增加Warburg效應可以促進腫瘤細胞增殖，通過合成代謝過程避免細胞凋亡[6]。值得注意的是，產生的乳酸會導致酸性腫瘤微環境的形成，這種低pH環境可影響腫瘤免疫監測的各個部分，以驅動免疫逃逸[7]，因此，有必要探究LDH表達在胃癌中的臨床價值以及對免疫微環境可能產生的影響。雖然，目前已有大量的體外研究關注LDHA在胃癌中的調控作用，包括其上下游的靶向結合關系[8]，以及對糖酵解的影響[9]，但鮮有研究關注LDHB在胃癌中的作用以及預后價值。因此，本實驗重點探討LDHA和LDHB表達與胃癌患者預后的關系，并使用ssGSEA算法探究不同亞型對胃癌組織免疫微環境的影響。

1 材料與方法

1.1 數據集來源及預處理從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數據庫下載HTseq-FPKM格式的407例胃癌患者的轉錄組數據，對原始數據進行log2轉化后，比較組織中LDH mRNA的表達。另外，從上述數據庫下載全體胃癌患者的臨床數據，對407例具有LDH表達信息的樣本與臨床信息進行匹配，最終納入375例具有完整LDH表達信息和臨床病理數據的胃癌標本。從HPA(https://www.proteinatlas.org/)數據庫下載胃癌患者的LDH免疫組化染色圖片，其中LDHA染色包括11例正常人群及36例胃癌患者；LDHB染色包括12例正常人群及44例胃癌患者，對所有圖片使用Image pro plus軟件分析光密度值(IOD)。

1.2 生物信息學ssGSEA算法其根據每個樣本中全轉錄組數據的表達，計算每個基因的rank值，對24種免疫細胞的含量進行評估。24種免疫細胞包括aDC細胞、B細胞、CD8+T細胞、細胞毒細胞、DC細胞、嗜酸性粒細胞、iDC細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、NK CD56bright細胞、NK CD56dim細胞、NK細胞、pDC細胞、T細胞、輔助T細胞、Tcm細胞、Tem細胞、TFH細胞、Tgd細胞、Th1細胞、Th17細胞、Th2細胞和Treg細胞。

1.3 統計學分析采用R軟件v4.0版本進行統計學分析，Image pro plus軟件計算免疫組化染色的IOD值。采用t檢驗分析計量資料差異，采用χ2檢驗分析計數資料差異，采用Cox回歸模型篩選患者預后相關的獨立預測因素，采用Kaplan-Meier法進行生存分析并進行Log-rank檢驗。采用Pearson法進行免疫組化分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及正常組織中LDHA和LDHB的表達與癌旁正常組織相比，胃癌組織中LDHA的mRNA表達量明顯上調(P<0.05，圖1A)。IOD半定量分析顯示，胃癌組織中LDHA蛋白表達量明顯上調(P<0.05，圖1B)，并且染色強度更深(圖1C)。另外，胃癌組織中LDHB的mRNA(圖1D)及蛋白表達量(圖1E)同樣明顯上調(P均<0.05)，且染色強度更深(圖1F)。

圖1 胃癌組織及癌旁正常組織中LDHA和LDHB的表達：A.LDHA mRNA的表達量；B.LDHA蛋白的IOD數值；C.LDHA的免疫組化染色，SP法；D.LDHB mRNA的表達量；E.LDHB蛋白的IOD數值；F.LDHB的免疫組化染色，SP法

2.2 LDHA及LDHB表達與胃癌臨床病理特征的關系以LDHA和LDHB表達的中位值作為截斷值，將全體患者分為高表達組(188例)和低表達組(187例)，發現LDHA表達與患者性別和年齡有關；LDHB表達與患者性別、T分期、病理分期、組織學分級有關(P均<0.05，表1)。

表1 LDHA及LDHB表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 LDHA及LDHB表達與胃癌患者總生存期(overall survival, OS)的關系LDHA高表達組患者的OS明顯短于低表達組患者(P<0.05)；LDHB高、低表達組患者的OS無明顯差異(P>0.05，圖2)。Cox回歸分析結果顯示，LDHA表達與患者年齡、M分期一樣，均是胃癌患者OS的獨立預后因素(P均<0.05，表2)。LDHB表達與患者OS無關(P>0.05)，但年齡和M分期仍是胃癌患者OS的獨立預后因素(P均<0.05)。

表2 Cox回歸分析患者OS的相關因素

圖2 A.LDHA表達與胃癌患者總生存期的關系；B.LDHB表達與胃癌患者總生存期的關系

2.4 LDHA及LDHB表達與胃癌患者無瘤生存期(disease-free survival, DFS)的關系LDHA高表達組患者的DFS與低表達組患者相比，差異無顯著性(P>0.05)；LDHB高表達組患者的DFS與低表達組患者相比明顯縮短(P<0.05，圖3)。Cox回歸分析結果顯示，LDHA表達與患者的DFS無關(P>0.05)，LDHB表達對患者DFS具有較強的獨立預后價值(P<0.05，表3)。

圖3 A.LDHA表達與胃癌患者無瘤生存期的關系；B.LDHB表達與胃癌患者無瘤生存期的關系

表3 Cox回歸分析患者DFS的相關因素

2.5 LDHA及LDHB表達對胃癌組織免疫微環境的影響LDHA表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞的含量呈正相關(P均<0.05)；與NK CD56bright細胞、嗜酸性粒細胞、pDC細胞、B細胞、肥大細胞、Tem細胞、Tcm細胞、TFH細胞以及NK細胞的含量呈負相關(P均<0.05)。僅NK細胞與LDHB表達呈負相關(P<0.05)；LDHB表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞、Treg細胞以及輔助T細胞含量呈正相關(P均<0.05，圖4)。另外，LDHB高、低表達組中有差異的免疫細胞數目較少。在不同LDHB表達的患者中，嗜酸性粒細胞、pDC細胞、輔助T細胞、Tem細胞、Th17細胞、Th2細胞的含量具有明顯差異(6/24)(P<0.05)。值得注意的是，在不同LDHA表達的患者中，大部分免疫細胞的含量差異均有顯著性(14/24)(P<0.05，圖5)。

圖4 A.LDHA表達與24種免疫細胞的相關性分析；B.LDHB表達與24種免疫細胞的相關性分析

圖5 A.LDHA高、低表達組與24種免疫細胞含量的差異分析；B.LDHB高、低表達組與24種免疫細胞含量的差異分析；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，發病率位居惡性腫瘤的第2位，病死率位居第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。在酸性環境中的腫瘤代謝重編程[10]與PD-L1等相關的免疫逃逸機制已被證明在胃癌中具有重要作用[11]。因此，本實驗著重探討導致腫瘤酸性環境關鍵酶的兩種亞型對胃癌的臨床價值以及對腫瘤免疫微環境的影響。

乳酸生成的增加和H+離子的積累，最終導致腫瘤微環境的酸化，目前相關研究已證明腫瘤組織中酸性環境與免疫反應之間存在密切聯系[12]。大多數情況下，酸性環境導致CD8+T細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞的活性下調，而促進調節性T細胞和骨髓源性抑制細胞的招募，從而刺激免疫抑制[13]。另外，相關研究支持LDH在腫瘤進展中的作用，如在C57BL/6小鼠胰腺癌模型成瘤實驗中，敲除LDHA表達后腫瘤大小小于對照組；在相同的模型中，LDHA敲低的腫瘤中NK細胞表現出更高的活性[14]。與此同時，黑色素瘤中LDH相關的乳酸積累被證明可以抑制T細胞和NK細胞對腫瘤的監測作用，但有趣的是其抑制作用被認為涉及乳酸誘導的T細胞和NK細胞中NFAT的下調，從而減少了IFNγ的產生[15]。該結論提示，LDH活化可能在不同環境下同時具有促炎和抗炎作用。目前，LDHA在胃癌中表達的研究報道較多，如mTOR/PKM2和STAT3/C-Myc信號通路可降低LDHA的表達，并調節其能量代謝和腫瘤微環境[16]。且相關臨床研究結果亦表明，LDH的水平對胃癌患者預后有著較強的預測價值[17]，檢測化療前LDH水平也可預測中晚期胃癌患者姑息性化療預后[18]。同以往文獻報道一致，本實驗亦認為LDHA與患者預后密切相關，并且在OS中有著較好的獨立預測價值。另外本實驗確定了LDHA表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞的含量呈正相關；與NK CD56bright

細胞、嗜酸性粒細胞、pDC細胞、B細胞、肥大細胞、Tem細胞、Tcm細胞、TFH細胞以及NK細胞的含量呈負相關。這些結果也可為我們未來在LDH與免疫逃逸的基礎研究中提新思路。另外，不同LDHA表達的胃癌患者，其DFS結局差異無統計學意義。但隨后本實驗發現LDHB是胃癌患者DFS的獨立危險因素，其結果可作為LDHA的補充。遺憾的是，關于LDHB對胃癌組織中免疫微環境和預后價值的研究較少。但本實驗提供了該亞型對胃癌患者DFS的預后價值，并且揭示了LDHB表達對免疫細胞浸潤豐度的影響，包括嗜酸性粒細胞、pDC細胞、輔助T細胞、Tem細胞、Th17細胞、Th2細胞。這些結果提示，LDHB的表達可能同LDHA一樣，也具有一定的免疫調節價值。

目前，雖然胃癌中已有部分標志物的預后作用被深入研究，如SPIN1[19]、AXIN2[20]等,但本實驗對探究胃癌中乳酸代謝關鍵酶的關鍵作用提供了新思路。本實驗也存在一定的局限性：(1)根據美國公開回顧性數據集，LDH的預后效能可能還需國內病例數據進行下一步驗證。(2)由于該數據集缺乏統一的病理分型，未進行各病理亞型的分層分析，如傳統病理分型或分子亞型。雖然，ssGSEA算法在生物信息學領域已被廣泛應用，但仍需體外實驗驗證。另外，值得注意的是，本實驗雖然提示LDHA及LDHB表達對免疫細胞的影響，并且阻斷腫瘤乳酸代謝可能是腫瘤治療的另一種可以嘗試的途徑，但目前針對免疫細胞的治療方法具有強毒性，得出的某些實驗結果需謹慎應用。