彌漫大B細胞淋巴瘤中Trx、TrxR-1及TXNIP的表達及臨床意義

黃云霞，時杜娟，蒙玉娜，馬淑萍，黨春艷，李紅玲

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)最常見的一種類型，約占NHL的40%[1-2]，多為原發性DLBCL，也可由惰性淋巴瘤進展或轉化而來。硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)及還原型輔酶Ⅱ共同構成了Trx系統，該系統可調節細胞氧化還原狀態，是人類細胞中重要的抗氧化蛋白[3]。近年，許多研究表明Trx系統與腫瘤的關系非常密切，其影響腫瘤的發生、發展、增殖、凋亡過程[4]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是一種普遍表達的抑癌基因，在多種腫瘤組織中低表達。TXNIP可與Trx結合，抑制其抗氧化活性，從而參與細胞中的氧化應激，同時參與調節體內活性氧系統以及線粒體通路過程，發揮誘導細胞凋亡的作用[5-6]。本實驗采用免疫組化法檢測Trx、TrxR-1及TXNIP在DLBCL中的表達，分析上述三種蛋白與DLBCL臨床病理特征的關系，為DLBCL的臨床診斷、病情評估提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年6月甘肅省人民醫院診治的60例DLBCL，淋巴結反應性增生組織20例。60例DLBCL患者年齡18～80歲，中位年齡54歲，男女比為3 ∶2。DLBCL組納入標準：符合DLBCL診斷標準；年齡范圍16～80歲；相關臨床資料完整；初診患者，病理活檢前均未進行任何放、化療等抗腫瘤治療。排除標準：急性感染性疾病患者；糖尿病患者；合并其他惡性腫瘤患者；阿爾茲海默癥患者；心血管疾病患者。本實驗經甘肅省人民醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及方法Trx抗體、TrxR-1抗體和TXNIP抗體均為兔多克隆抗體，Trx抗體(稀釋比1 ∶250)和TXNIP抗體(稀釋比1 ∶500)購自英國Abcam公司，TrxR-1(稀釋比1 ∶500)抗體購自GeneTex公司。選取甘肅省人民醫院病理科存檔的組織蠟塊，切片后脫蠟、水化，采用免疫組化SP法檢測三種蛋白的表達。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明進行，用已知陽性切片作為陽性對照，PBS作為陰性對照。

1.3 結果判定Trx和TrxR-1表達主要定位于細胞質，TXNIP表達主要定位于細胞核。通過半定量法分析細胞染色強度和陽性細胞所占的百分比評分：(1)按細胞染色強度進行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比進行評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數<25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分結果相乘：0分為(-)，1～5分為(+)，6～8分為()，8～12分為()。其中<1分為陰性，≥1分為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗，當出現1

2 結果

2.1 DLBCL和淋巴結反應性增生組織中Trx、TrxR-1和TXNIP的表達DLBCL中Trx和TrxR-1表達主要定位于細胞質(圖1、2)，TXNIP表達主要定位于細胞核，而在DLBCL中表達主要定位于細胞質(圖3)。DLBCL中Trx和TrxR-1的陽性率分別為68.33%(41/60)、76.67%(46/60)，淋巴結反應性增生組織中Trx和TrxR-1的陽性率分別為25.00%(5/20)、35.00%(7/20)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。DLBCL和淋巴結反應性增生組織中TXNIP的陽性率分別為20.00%(12/60)、80.00%(16/20)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 彌漫大B細胞淋巴瘤和淋巴結反應性增生組織中Trx、TrxR-1及TXNIP的表達[n(%)]

圖1 A.彌漫大B細胞淋巴瘤中Trx陽性；B.淋巴結反應性增生組織中Trx陽性，SP法 圖2 A.彌漫大B細胞淋巴瘤中TrxR-1陽性；B.淋巴結反應性增生組織中TrxR-1陽性，SP法 圖3 A.彌漫大B細胞淋巴瘤中TXNIP陽性；B.淋巴結反應性增生組織中TXNIP陽性，SP法

2.2 Trx、TrxR-1和TXNIP表達與DLBCL臨床病理特征的關系Trx、TrxR-1和TXNIP的表達與DLBCL臨床分期和IPI評分有關(P<0.05)，Trx和TrxR-1在DLBCL中的表達亦與B癥狀有關，與患者年齡、性別、乳酸脫氫酶無關，差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 Trx、TrxR-1及TXNIP蛋白表達與彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 Trx、TrxR-1單項檢測及聯合檢測對DLBCL診斷的價值ROC結果表明，Trx與TrxR-1聯合檢測AUC為0.767，高于單獨檢測(表3)。

表3 Trx、TrxR-1單項及聯合檢測對彌漫大B細胞淋巴瘤診斷的價值

3 討論

DLBCL的發病率隨年齡增長而增加，每年歐洲的發病率為3～4人/10萬，美國的發病率約為4.68人/10萬[7]。目前，DLBCL患者的標準治療方案是利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松(R-CHOP)，治療效果與分期、年齡、有無重大疾病和國際預后指數(international prognostic index, IPI)等各種因素有關。在DLBCL中，50%～60%患者對化療反應良好，但部分患者因復發、耐藥等因素導致治療效果差[8]。因此，亟需尋求新的DLBCL治療靶點。

氧化應激是生物體細胞在遇到各種應激刺激時，機體內產生高水平物質，如活性氧、氮自由基等，各種氧化物導致的氧化速度超出了機體的抗氧化能力，最終導致氧化應激損傷人體組織，氧化應激的本質即體內氧化-抗氧化系統的失衡。幾乎所有腫瘤細胞均有一個共性，即細胞內氧化還原體系失衡[9-11]。Trx蛋白系統是人類細胞中重要的抗氧化蛋白，由Trx、TrxR和NADPH組成，主要定位于細胞質(Trx-1和TrxR-1)和相應的線粒體(Trx-2和TrxR-2)。TrxR存在三種異構體，除了細胞質中的TrxR-1和線粒體中的TrxR-2，還有睪丸中的TrxR-3。TrxR-1的文獻報道較多，本實驗采用免疫組化法檢測TrxR-1在DLBCL中的表達。根據癌癥的不同階段，Trx系統可在癌癥的發展中起雙向作用[12]。在癌癥發生早期，該系統的直接抗氧化功能可抵御致癌物引起的氧化應激，從而預防正常細胞的惡變。然而，一旦出現腫瘤表型，TrxR/Trx表達水平的升高可能會促進腫瘤的發展、轉移以及影響患者預后[12-14]。因此，相對于非癌組織，TrxR/Trx在多種腫瘤組織中過表達[15-18]。本實驗結果表明，與淋巴結反應性增生組織相比，Trx、TrxR-1在DLBCL中的表達明顯高于淋巴結反應性增生組織(P<0.05)，這與已報道的國內外相關研究結果相符。本實驗結果亦表明，DLBCL表達與患者臨床分期、IPI評分密切相關(P<0.05)。已有大量研究表明，TrxR/Trx的抑制劑具有抗腫瘤效果[19-21]，結合本實驗結果進一步驗證了Trx系統作為腫瘤治療的靶點，并為判斷患者預后提供參考。同時ROC結果表明，通過聯合檢測Trx和TrxR-1的表達也可為DLBCL診斷提供一定的參考價值。

TXNIP是一種抑癌基因，作為Trx的內源性抑制劑，也被認為是Trx的系統成員[22]。在正常生理條件下，TXNIP主要定位于細胞核，在細胞質中也可少量分布。當細胞應對氧化應激時，細胞核中的TXNIP會轉移到線粒體中，與線粒體中的TRX2結合，從而釋放與TRX2結合的凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulating kinases 1, ASK1)，激活ASK1介導的細胞凋亡途徑[6]。本實驗結果表明，TXNIP在DLBCL中陽性率明顯低于淋巴結反應性增生組織(P<0.05)，其表達水平與DLBCL臨床分期及B癥狀有關。有研究表明，TXNIP在前列腺癌中表達下調，其表達水平與前列腺癌患者的惡性臨床病理學特征呈負相關[23]。另外一些研究結果亦表明，TXNIP在腫瘤組織或細胞中低表達[24-26]。這些研究與本實驗結果一致，結合本實驗結果，作者推測TXNIP可能在DLBCL發生、進展中起負性調控作用。鑒于本組樣本量較少，可能會有統計學偏差，故需要大量樣本進一步證實并明確其抗腫瘤機制，為DLBCL的治療提供新思路。

綜上所述，本實驗結果表明，Trx和TrxR-1在DLBCL中高表達，可能參與了DLBCL的發生、發展，兩者聯合檢測為DLBCL的診斷提供一定的參考價值。TXNIP在DLBCL中低表達，提示TXNIP發揮腫瘤抑制作用，可進一步探究TXNIP在DLBCL中的作用機制，為DLBCL的治療提供新思路。