熒光PCR法檢測石蠟標本中結核分枝桿菌的流程改進

張玲娜，周晶晶，王俏洋，蔡鶯鶯，甘梅富

結核分枝桿菌的檢測對于有肉芽腫性炎特征組織病變的病理診斷具有重要的參考意義。目前，病理科常用的檢測方法有基于細菌學的抗酸染色、金胺O熒光染色，基于分子病理學的PCR、Xpert MTB/RIF檢測[1-2]等。其中熒光PCR技術具有敏感性高、特異性好、速度快，且價格實惠的特點，被廣泛應用于大中型醫院病理科福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)組織的結核分枝桿菌的檢測中[3-6]。由于石蠟組織標本中的病菌分布不穩定，以及存在核酸的交聯、降解等因素，熒光PCR法的靈敏度雖然比抗酸染色高，但仍存在一定的假陰性及臨界性的結果，作者在實踐中發現，通過對核酸標本進行濃縮處理再上機，可以幫助改善上述問題，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年～2021年浙江省臺州醫院存檔的手術切除或者活檢，病理診斷為肉芽腫性炎或凝固性壞死的石蠟標本364例，其中大標本242例，小標本122例。

1.2 儀器與試劑CV200真空離心濃縮儀購自北京吉艾姆公司，ABI7500熒光PCR儀購自ThermoFisher公司。核酸提取試劑(型號FFPE DNA)購自廈門艾德公司，結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自湖南圣湘公司。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 使用一次性棉簽、刀片、無菌鑷子連續5 μm厚切片(大標本5張，小標本10張)置于無菌離心管中，采用核酸提取試劑(按試劑盒說明書操作，其中添加DTB與無水乙醇后，置于56 ℃中加熱1 min再離心)進行DNA的提取，最后洗脫體積為40 μL。

1.3.2熒光PCR檢測 將反應液、酶混合液、內標核酸以38 ∶2 ∶1的比例充分混勻成PCR-混合液，每管40 μL分裝到八聯管，最后加入5 μL DNA樣本作為PCR反應模板上機檢測。對于測定Ct值<37的樣本，判定為結核分枝桿菌DNA陽性；37≤Ct值≤39的樣本，為臨界陽性；Ct值>39的樣本，同時，內標檢測為陽性(Ct值≤40)，判定為結核分枝桿菌DNA陰性；若內標Ct值>40或無顯示，則該樣本的檢測結果無效，查找并排除原因，并對此樣本進行重復實驗。

1.3.3核酸濃縮 將364例標本熒光PCR檢測得到的臨界陽性病例、陰性但有翹尾病例以及曲線異常病例的DNA樣本管(1.5 mL離心管)開蓋置于真空離心濃縮儀中，開啟真空泵、冷阱、濃縮儀1 500 r/min，26 ℃離心濃縮5 min；濃縮結束后閉上管蓋，混勻離心備用。

2 結果

2.1 傳統熒光PCR法檢測情況364例中檢出陽性150例，臨界陽性7例，陰性207例，其中陰性病例中有13例略有翹尾現象(圖1A)。本實驗將臨界陽性和有翹尾的20例歸為臨界病例。

2.2 改良熒光PCR法檢測情況臨界病例的核酸用真空離心濃縮儀濃縮5 min之后，再使用熒光PCR法檢測，結果發現，原7例臨界陽性病例，5例檢出為明確陽性，2例為臨界陽性；原13例陰性病例采用改良法檢測后，3例檢出為明確陽性，2例為臨界陽性。4例臨界陽性經重復確定為陽性病例。陽性病例中改良檢測法熒光曲線相對更明顯，Ct值明顯小于傳統檢測法，更易于判斷(圖1B)。20例標本中，初始核酸濃度最小值17.7 ng/μL，最大值為557.1 ng/μL，平均濃度207.3 ng/μL，所有標本的內標VIC曲線均正常升起。

圖1 傳統和改良熒光PCR檢測TB DNA擴增對比圖：黃色曲線為陽性對照，綠色曲線為檢測樣本：A.傳統熒光PCR法，TB DNA檢測曲線有翹尾，但是在基線以下；B.改良熒光PCR法，TB DNA曲線CT值為36.8，結果為陽性

2.3 改良熒光PCR法特異性驗證取4例無病變的正常組織，4例檢測結果為結核分枝桿菌核酸強陽性的病例，同一批切片，提取DNA，同時進行濃縮操作，同時上機，發現4例正常組織檢測結果全部為陰性，且沒有任何翹尾現象；另外4例仍為強陽性，說明濃縮過程沒有造成交叉污染。

3 討論

隨著越來越多醫院的檢測中心尤其是病理科自身建立起規范的PCR實驗室，熒光PCR檢測方法以其優越的敏感性、特異性、方便性，給結核分枝桿菌的病理診斷帶來可喜的變革。本組364例標本中，93例進行了抗酸染色，僅10例陽性，而用熒光PCR法檢測出了47例陽性。有研究[7]結合隨訪數據計算得出，熒光PCR法的靈敏度為71.3%，特異度為99.4%，準確率為79.1%，其中靈敏度、準確率遠高于抗酸染色的41.5%、55.7%，實驗中他們亦發現有16例隨訪明確為結核，抗酸染色陽性，熒光PCR法卻未檢測出陽性，重新分析其中有13例抗酸染色為單個菌陽性或可疑陽性，部分病例核酸擴增曲線有翹尾但未達到陽性標準。

由于不同石蠟組織標本中病菌分布差異較大，以及存在核酸交聯、降解等不利因素，熒光PCR法仍存在一定比例的假陰性以及臨界的情況。本組改良版核酸濃縮-熒光PCR法通過富集核酸，提高模板量，可有效減少由于組織含菌量太少、穿刺標本太少等導致的假陰性結果(13例臨界標本中發現了5例假陰性)，另一方面也減少了臨界病例數量。濃縮過程并沒有增加交叉污染的機會，且操作簡便，避免了資源浪費，提高了檢測的準確性和靈敏度，為結核特別是不典型結核病的相關病理診斷提供更準確的依據。

另外，作者在預實驗中發現以下幾項注意點：(1)如果提取的核酸濃度過高，不建議繼續濃縮，預實驗結果表明如果濃縮后的核酸濃度超過1 000 ng/μL，有可能會導致內標VIC曲線異常，檢測結果不可信；(2)核酸提取試劑的DTL溶液，即裂解液，可能含有SDS等明確會抑制PCR的強表面活性劑成分，在后續操作中務必去除干凈，其中關鍵環節是樣品添加DTB與無水乙醇形成白色沉淀后，建議置于56 ℃金屬浴中加熱1 min等全部透明再離心，否則會造成最后洗脫的核酸中含有一定抑制劑，再加上濃縮操作后直接影響結果；(3)核酸洗脫液中一般含有Tris-HCl等離子成分，濃縮過程中可能會造成體系中離子濃度升高，預實驗發現濃縮至原體積的1/3，內標VIC曲線仍正常，也可改成稀釋處理的洗脫液或者蒸餾水進行洗脫，減少后顧之憂；(4)不濃縮但是降低洗脫液體積也是可選項，但可能會導致洗脫不充分，降低洗脫率。

本實驗所用的試劑盒是同類型結核分枝桿菌檢測試劑盒中少見的含有內標的試劑盒，該內標是指外加的含內標基因片段的克隆質粒，內標片段長97 bp，與本組檢測的目的基因長度相似(116 bp)，優勢在于可以評估PCR反應是否正常以及是否有效，減少由于PCR反應異常導致的假陰性。但本實驗仍有一些不足之處，反應體系不包含組織內參基因，無法嚴格反映所提取樣本的質量，例如檢測脫鈣的標本結果陰性，不排除核酸遭到嚴重破環從而導致無法檢出的原因。因此，對于核酸濃度極低或者OD260/280比值異常的病例，需謹慎評估。