電針對 STZ誘導的糖尿病神經痛大鼠脊髓小膠質細胞和 P2X4的干預作用

陳芷羽,胡群祺,馬益琪,費雪瑜,李想,蔣晨琳,王涵芝,瞿思穎,方劍喬,何曉芬,蔣永亮

(浙江中醫藥大學第三臨床醫學院康復醫學院,杭州 310053)

糖尿病神經痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是一種常見的糖尿病并發癥,屬于典型的外周性神經病理性疼痛[1]。DNP常表現為對熱和機械性刺激的敏感性增高。DNP癥狀可采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病鼠模型進行模擬,STZ誘導的糖尿病模型大鼠有較長的病程,造模后可出現顯著的熱痛和機械痛變化[2],有很多研究通過檢測大鼠機械痛閾和熱痛閾來評價DNP模型[3-4]。

小膠質細胞在調節DNP的形成中發揮著重要作用,已成為治療 DNP的重要靶點[5]。脊髓中離子鈣結合適配器分子(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1)是小膠質細胞的標記物之一。脊髓背角離子通道型嘌呤能受體 P2X4(purinergic ligand-gated ion channel 4 receptor, P2X4R)在神經病理性痛痛覺過敏中起重要作用,P2X4R的表達下調,痛覺過敏癥狀明顯減輕甚至逆轉[6-7]。目前電針已被廣泛用于治療各種慢性疼痛,已有研究表明電針能緩解DNP[8-9],但其鎮痛機制有待進一步明確和探究。已有研究表明,在坐骨神經慢性壓迫性損傷模型中,電針可能通過下調P2X4R表達以提高大鼠熱痛閾[10]。ZHENG Y等[11]研究表明電針可降低小膠質細胞P2X4R的高表達緩解 L5脊神經結扎誘導的神經病理痛,但電針對DNP模型大鼠脊髓P2X4R的干預作用有待研究。因此本實驗通過建立DNP大鼠模型來探討電針鎮痛是否與其有效干預脊髓背角小膠質細胞和P2X4R表達有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只,體質量(200±50)g,由中國科學院上海實驗動物中心動物科學實驗中心提供,許可證號為SCXK(滬)2018—0006。大鼠在12 h明暗交替、溫度20～25 ℃、濕度45%～55%的環境中飼養,允許大鼠自由攝食和飲水。適應性喂養7 d后開始實驗操作。實驗過程中所有的操作嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》中對實驗動物進行處置的相關規定。

1.2 實驗試劑與儀器

鏈脲佐菌素(S0130,美國Sigma),兔抗Iba1抗體(ab178846,英國 Abcam),兔抗 P2X4抗體(APR-002,以色列 Alomone),山羊抗兔二抗(7074,美國 CST),韓氏穴位神經刺激儀(HANS-200E,南京濟生醫療科技有限公司),足底熱痛儀(37370,意大利 Ugobasile),血糖儀(德國 Roche Diagnostics GmbH),純水儀(美國Thermo Fisher Scientific),全波長酶標儀(美國Molecular Devices),電泳儀(美國 Bio-Rad),轉印儀(美國 Bio-Rad),凝膠成像儀(美國 Bio-Rad),移液器(德國Eppendorf),pH計(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 分組與模型制備

將20只大鼠隨機選取6只作為對照組,對其余14只大鼠禁食16 h后參照KAUR N等[12]造模方法予以腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg),監測大鼠體質量、空腹血糖和熱痛閾。空腹血糖值≥16.7 mmol·L-1,熱痛閾下降≥15%以上[13-14]則表示DNP造模成功。DNP造模成功的大鼠有12只。對照組大鼠予以注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

1.4 干預方法

電針干預于造模后第 14天開始,選取自制的布套[15]將大鼠予以固定,根據邰昭霞等[16]實驗大鼠選穴依據,選取大鼠膝關節后外側,在腓骨小頭下5 mm的足三里穴和大鼠后肢外踝尖與跟腱之間凹陷處的昆侖穴。用規格為0.25 mm×13 mm的針灸針進行針刺,并連接電針儀進行電針干預,電針頻率為 2 Hz,強度為1～2 mA,每次治療30 min,每日1次,連續電針7 d。對照組和模型組大鼠于電針組干預的相同時間段不做任何干預,僅予以固定,每次固定 30 min,連續固定7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 空腹血糖測定

用尾靜脈采血檢測各組大鼠的空腹血糖,并在0 d、7 d、14 d、21 d測大鼠的體質量。

1.5.2 熱痛閾測定

參照FEI X Y等[17]測定大鼠熱痛閾的方法,待大鼠安靜后采用足底熱痛儀照射大鼠足底中部直至其產生抬足、舔足的反應時間,記作熱痛閾。檢測大鼠0 d、7 d、14 d、21 d足跖熱痛閾。

1.5.3 脊髓組織中Iba1和P2X4R蛋白表達檢測

參考杜俊英等[18]取大鼠脊髓背角的方法,腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠并對其進行開胸,用生理鹽水快速灌注左心室及升主動脈至大鼠肝臟發白。將大鼠開背置于冰上,剪斷脊柱兩旁的肋骨,剪取L4節段以上約5 cm的脊柱,用50 mL注射器沖出脊髓,留取中間膨大區域并用刀片切取大鼠脊髓背角,放置超低溫冰箱保存備用。用Western blot法檢測小膠質細胞標記物Iba1和P2X4R蛋白表達。取出大鼠脊髓背角,加入裂解液,勻漿后離心。用BCA試劑盒進行蛋白定量檢測,再進行SDS-PAGE凝膠電泳,將分離的蛋白電泳至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗,稀釋比依次為兔抗 Iba1(1:1 000),P2X4R(1:1 000),內參β-actin抗體(1:5 000),4 ℃過夜。TBST洗滌3次后加入山羊抗兔二抗孵育1 h,用TBST洗滌3次,最后用ECL顯影。應用Image J軟件對結果進行圖像分析,計算目的蛋白與β-actin的灰度比值。

1.6 統計學分析

采用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示;重復測量數據采用多次重復測量方差分析方法分析,其余數據采用單因素方差(one-way ANOVA)分析;若方差齊,組間兩兩比較采用LSD法,若方差不齊則采用Dunnett’s T3分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化

各組大鼠 0 d體質量比較,差異無統計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d體質量明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在7 d體質量上升,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化情況

2.2 各組大鼠空腹血糖變化

各組大鼠 0 d空腹血糖比較,差異無統計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d空腹血糖明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖變化情況

2.3 各組大鼠熱痛閾變化情況

各組大鼠0 d和7 d熱痛閾比較,差異無統計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組大鼠在14 d、21 d熱痛閾明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01);與對照組比較,電針組大鼠在14 d熱痛閾明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在21 d熱痛閾明顯升高(P＜0.01)。詳見圖3。

圖3 各組大鼠熱痛閾變化情況

2.4 各組大鼠脊髓Iba1、P2X4R蛋白表達水平

與對照組比較,模型組Iba1、P2X4R蛋白表達明顯增加,差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較,電針組Iba1、P2X4R蛋白表達顯著減少,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠脊髓Iba1蛋白表達情況

圖5 各組大鼠脊髓P2X4R蛋白表達情況

3 討論

糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一[19],糖尿病神經痛(DNP)是其常見的并發癥之一[20]。DNP在臨床上表現為肢體疼痛、感覺減退、麻木、灼熱、冰涼等,也可表現為自發性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏,甚至發展至糖尿病足潰瘍或需要截肢,嚴重影響患者生活質量。STZ可誘發糖尿病[21],它可通過破壞胰島β細胞,導致血糖升高[22]。本實驗采用單次腹腔注射STZ誘導DNP大鼠模型,STZ注射后大鼠出現體質量下降,空腹血糖明顯上升,在STZ注射2周后熱痛閾下降,且持續至模后3周,說明DNP造模成功。

足三里為足陽明胃經的合穴,《靈樞·五邪》:“邪在脾胃,則病肌肉痛,陽氣有余,陰氣不足,則熱中善饑;陽氣不足,陰氣有余,則寒中腸鳴腹痛;陰陽俱有余,若俱不足,則有寒有熱,皆調于三里。”由此可見,除了本經的作用養胃健脾,足三里還可以鎮痛、平衡陰陽。有研究證明針刺足三里可以提高痛閾[23],臨床治療急性腎絞痛[24]、癌痛[25]、肩周炎[26]、三叉神經痛[27]效果顯著。昆侖為足太陽膀胱經的經穴,《針灸大成》中提到“昆侖主腰尻腳氣,足腨腫不得履地,鼽衄,腘如結,踝如裂,頭痛,肩背拘急,咳喘滿,腰脊內引痛……”,可見昆侖對身體各部有鎮痛作用,臨床多用來治療腰扭傷[28]、坐骨神經痛[29]、眉棱骨痛[30]等,近年來在無痛分娩[31]方面也取得了成效。更有研究發現,電針下肢穴位鎮痛效果比上肢更明顯[32],故本實驗選取足三里和昆侖二穴治療DNP。研究結果表明,電針可提高DNP大鼠的熱痛閾。

研究發現鞘內注射小膠質細胞抑制劑米諾環素[33]和P2X4R拮抗劑可抑制脊髓小膠質細胞和P2X4R的表達[4]。小膠質細胞源性腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的合成與釋放與P2X4R密切相關[34-35]。周圍神經損傷后,P2X4可通過刺激小膠質細胞釋放 BDNF作用于脊髓背角神經元的酪氨酸激酶B受體參與神經痛[36]。王英等[37]研究表明,電針能夠通過調節神經元內生物活性物質的合成與釋放以發揮鎮痛效應。ZHENG Y等[38]研究還發現電針可通過下調大鼠脊髓P2X4R緩解神經病理性疼痛。課題前期研究[39]表明,電針可能通過抑制DNP大鼠脊髓背角小膠質細胞表達和 BDNF的表達發揮鎮痛作用。故本課題進一步探究電針治療DNP除了與下調DNP大鼠脊髓小膠質細胞BDNF有關以外,是否還與其有效干預脊髓小膠質細胞和 P2X4R有關。研究結果表明,STZ注射后模型組大鼠脊髓背角上小膠質細胞和P2X4蛋白表達增多,電針可下調其蛋白表達。

綜上所述,低頻電針能有效改善糖尿病神經痛,可能與其有效干預脊髓小膠質細胞和 P2X4蛋白表達有關。