電針對絕經后骨質疏松癥模型大鼠腸黏膜維生素D膜相關性快速反應類固醇結合蛋白表達的影響

石娜,朱崇田,歐陽鋼

(1.臨沂市人民醫院,臨沂 276003;2.江蘇省老年病醫院,南京 210024)

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是絕經后女性的常見疾病,發病率為25%～50%,多發生在55～70歲或絕經后5～10年內[1]。患者可出現全身乏力、骨痛等癥狀,且極易發生骨折[2]。骨質疏松性骨折是老年患者致殘和致死的主要原因,嚴重影響患者的生活質量,并增加了家庭和社會的負擔[3]。目前西醫主要以激素替代療法為主,但不良反應多,且有致癌的風險[4]。針灸可有效提高患者骨密度及雌激素值,是一種安全有效的治療方法[5-6]。研究發現,伴有消化系統疾病的患者其骨質疏松發生率明顯增高[7-8],這與鈣的吸收下降密切相關。1,25維生素D3膜相關性快速反應類固醇結合(membraneassociated rapid response steroid-binding,1,25D3-MARRS)蛋白和甲狀旁腺激素相關蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)為胃腸道內存在的特異性蛋白,二者結合后可促進小腸黏膜Ca2+的吸收,對PMOP的防治具有重要作用[9-10]。本研究擬通過觀察去卵巢大鼠腸黏膜1,25D3-MARRS表達與血清PTHrP、1,25(OH)2D3水平的變化,探討電針對鈣吸收的調節作用以及電針治療絕經后骨質疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性 SPF級 3月齡 SD大鼠 32只,體質量 180～200 g,未曾交配,購于浙江省實驗動物中心[許可證號 SCXK(浙)2014-0001]。在南京中醫藥大學實驗動物中心(屏障環境)喂養,環境溫度21～25 ℃,濕度40%～60%,光照時間每日12 h,飼養期間大鼠自由攝食飲水。動物喂養及實驗方案通過南京中醫藥大學倫理審查(倫理批號201812A023)。

1.2 主要試劑與儀器

MEDIX90雙能 X線骨密度檢測儀(法國奧斯托公司),雷勃爾離心機(北京雷勃爾離心機有限公司),Thermo ST16R低溫離心機,RT-6000酶標儀(深圳雷杜公司)。胎牛血清(FBS,美國 Gibco公司,貨號10099141),低糖DMEM培養基(美國Gibco公司,貨號11054001)、小鼠ERP57單克隆抗體(美國Santa公司,貨號sc-23886)、山羊抗小鼠IgG二抗(賽默飛公司,貨號A-11008)、戊巴比妥鈉購于德國默克公司(中國上海分裝,貨號 283256),ELISA試劑盒購于上海酶聯生物公司。

1.3 分組與造模

大鼠適應性飼養1周后,隨機分為空白組、假手術組、模型組及電針組,每組8只。模型組和電針組采用切除大鼠雙側卵巢的方法制備絕經后骨質疏松癥模型[11]。采用3%戊巴比妥鈉(按每100 g體質量0.1 mL)腹腔注射麻醉大鼠,局部去毛,取背側改良切口,最下肋下緣一橫指處與腰椎旁開一個半橫指處的交點為切口中心,縱行切開 0.8～1 cm,于深部脂肪層中可發現粉紅色卵巢,在子宮角處結扎后切除卵巢。假手術組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。為防止抗菌藥物對實驗結果的影響,術后不予注射或局部應用任何抗菌藥物。空白組大鼠不做任何處理。所有大鼠術后均自由攝食和飲水。

1.4 干預方法

造模后,電針組行電針干預。將大鼠裝于自制錐形袋內進行針刺。取關元和雙側三陰交為一組穴位,腎俞和雙側后三里為另一組穴位。取穴方法均參照《實驗針灸學》[12]中相關描述。每日取一組穴位,兩組穴位交替進行。用0.25 mm×25 mm針灸針刺入穴位后,接韓氏電針儀對雙側三陰交或雙側腎俞進行電刺激,強度2 mA,疏密波,頻率 2 Hz/15 Hz,電針 20 min。每日1次,每周連續治療5 d,間隔2 d,共治療12周。其余各組均不進行任何干預。

1.5 樣本采集

采集標本前一晚8點開始禁食,不禁水。第2天使用3%戊巴比妥鈉(按每100 g體質量0.1 mL)將大鼠進行腹部麻醉,將其置于無菌操作臺上,打開腹腔,腹主動脈取血,離心得血清后置于-20 ℃冰箱保存。取完血后,從十二指腸起始端剪下約10 cm小腸,無菌生理鹽水沖洗干凈后,剪刀縱行剪開腸腔,用烤過的載玻片刮下腸黏膜,用錫鉑紙包裹,迅速置于盛有液氮的容器中,-70 ℃冰箱凍存備用。大鼠放血致死后,剝離大鼠右側股骨及脛骨,徹底去除肌肉及肌腱等組織,用生理鹽水紗布包裹后放入EP管中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 觀測指標

1.6.1 骨密度

將大鼠離體股骨和脛骨自冰箱中取出,室溫下靜置30 min后,使用MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀進行骨密度檢測,進行數據分析,得出骨密度值。

1.6.2 血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和 RANKL水平

使用ELISA法進行檢測。按照說明書設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。分別設定空白孔和待測樣品孔,在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μL,然后再加待測樣品 10 μL。將樣品加于酶標板孔底部,不能觸及孔壁,輕輕晃勻,除空白孔外每孔加入酶標試劑100 μL,用封板膜封板后放至37 ℃溫育60 min;揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每個孔內加滿洗滌液,靜置 30 s后棄去,重復5次,最后拍干;每個孔內先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑 B 50 μL,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色 15 min;每個孔內加終止液 50 μL,終止反應;在加終止液后15 min以內測定,以空白孔調零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6.3 腸黏膜1,25D3-MARRS蛋白的表達

使用Western blot法檢測。根據試劑盒說明書提取總蛋白,煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,ERP 57單克隆抗體(1:100)作為目的蛋白,β-actin(1:1 000)作為內參,4 ℃過夜。山羊抗小鼠二抗(1:10 000)37 ℃孵育 2 h,洗膜后顯色,暗室內膠片曝光。采圖后用Gel-pro軟件圖像數據分析灰度值。

1.7 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件對數據進行分析處理。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析;方差齊性檢驗采用Leven法,若方差齊則采用LSD法進行兩兩比較,若方差不齊則采用Dunnett’T3法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠股骨及脛骨骨密度比較

與空白組比較,模型組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯降低(P＜0.01);與假手術組比較,模型組股骨及脛骨骨密度降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠股骨、脛骨骨密度升高(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 各組大鼠股骨及脛骨骨密度比較(每組8只大鼠)

2.2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較

與空白組比較,模型組和電針組血清 1,25(OH)2D3及 PTHrP水平明顯降低(P＜0.01);與假手術組比較,模型組和電針組血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組血清 1,25(OH)2D3及PTHrP水平明顯升高(P＜0.01,P＜0.05)。與空白組比較,模型組和電針組血清 OPG水平明顯降低(P＜0.01,P＜0.05);與假手術組比較,模型組血清 OPG水平明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組血清OPG水平明顯升高(P＜0.01)。與空白組比較,模型組和電針組血清RANKL水平明顯升高(P＜0.01);與假手術組比較,模型組和電針組血清 RANKL水平升高(P＜0.01);與模型組比較,電針組 RANKL水平明顯降低(P＜0.01)。與空白組比較,模型組血鈣水平明顯降低(P＜0.05);與假手術組比較,模型組血鈣水平明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,電針組血鈣水平明顯升高(P＜0.05)。與空白組比較,模型組和電針組血清OPG/RANKL值明顯降低(P＜0.01);與假手術組比較,模型組和電針組血清OPG/RANKL值降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組 OPG/RANKL比值明顯升高(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較(每組8只大鼠)

2.3 各組大鼠腸黏膜1,25D3-MARRS蛋白表達的比較

與空白組和假手術組比較,模型組 1,25D3-MARRS蛋白表達明顯降低(P＜0.01);與空白組比較,電針組1,25D3-MARRS蛋白表達明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,電針組 1,25D3-MARRS蛋白表達明顯升高(P＜0.05)。詳見圖3。

圖2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較(每組4個樣本)

3 討論

鈣是重要的骨礦物質元素,鈣的減少和丟失是引起骨密度下降并最終導致骨質疏松的重要因素之一[13]。近端小腸(十二指腸和近端空腸)是鈣吸收的主要部位,小腸黏膜病變或切除小腸后可導致骨密度下降,最終造成骨質疏松發病率增加[7-8],而這一過程受 1,25(OH)2D3、雌激素及甲狀旁腺激素(PTH)等多種激素的調控[14-15]。

1,25(OH)2D3是維生素 D在體內的活性形式,它對人體鈣磷代謝及骨骼系統的生長發育都有重要的作用[16-17]。破骨細胞的分化與功能也受1,25(OH)2D3的調控,當腸道鈣的攝取明顯下降時,1,25(OH)2D3會明顯增多,通過增強骨吸收并抑制骨質礦化以維持血清鈣正常水平[18]。1,25D3-MARRS是蛋白質二硫化物異構酶家族中的一員,可在小腸、腎、腦、骨等多種組織中表達[19-20],是 1,25(OH)2D3發揮作用的非基因組機制[21]。研究顯示,1,25D3-MARRS可以促進小腸對鈣的快速吸收。1,25(OH)2D3與小腸上皮細胞膜受體1,25D3-MARRS/ERp57結合后,先后激活磷脂酶 A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC),最終導致PLC釋放[22],從而達到促進鈣磷代謝的目的。大鼠去卵巢后 1,25(OH)2D3及 1,25D3-MARRS水平下降,會嚴重影響腸道鈣的吸收,從而導致骨質疏松。電針治療后血清 1,25(OH)2D3水平升高,腸黏膜1,25D3-MARRS表達也明顯增加,這種變化有利于促進腸道鈣的快速吸收,以促進骨形成,最終達到預防骨質疏松的目的。

PTHrP在人胃腸道黏膜中均有表達[23],可影響骨、腎、乳腺、胎盤等多種組織中的鈣吸收,是一種起效快、副作用少的骨形成促進劑[24-25]。PTHrP通過與 PTH1R相互作用,刺激 IGF-1合成,促進成骨細胞合成代謝[26]。給小鼠注入PTHrP后可以刺激十二指腸鈣吸收的增加,而胃泌素對十二指腸鈣的吸收并沒有作用[24]。另外,PTHrP缺失的小鼠出生后可出現頭部軟骨、肋軟骨發育不良及牙齒萌出障礙,說明PTHrP在骨骼發育、成骨及破骨代謝過程中發揮著重要的作用[27-28]。大鼠去卵巢后血清 PTHrP水平明顯下降,影響了成骨細胞合成及十二指腸對鈣的吸收,導致骨密度下降,電針可有效提高PTHrP水平,改善骨密度。

OPG和RANKL是破骨細胞形成、分化和調節的關鍵因子,OPG和RANKL的表達是骨吸收與重建的重要因素[29-31]。OPG/RANKL系統在機體中處于動態平衡,當比值下降時,會引起一些骨代謝疾病,而當比值升高時,會減弱破骨細胞的分化成熟,有利于骨重建[32]。大鼠去卵巢后 OPG/RANKL比值明顯下降,說明破骨細胞分化活躍,發生骨質疏松的風險性高。而電針可有效提高OPG/RANKL的比值,發揮骨保護的作用[33-34]。

《素問·宣明五氣》提出“腎主骨”,認為骨質疏松癥主要與腎關系密切;《素問·逆調論》中強調“腎者水也,而生于骨……不生則髓不能滿,故寒甚至骨也”。因此,本研究主要選擇具有補腎健脾作用的關元、三陰交、腎俞、后三里進行電針治療。研究結果發現電針可有效提高血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平,增加 1,25D3-MARRS蛋白表達,從而促進腸道鈣的重吸收,最終達到升高骨密度,治療骨質疏松的目的。另外,電針還可通過提高 OPG/RANKL的比值,減弱破骨細胞的分化,從而發揮骨保護作用。

綜上,腸道鈣吸收不良是罹患骨質疏松癥的重要原因,而電針可促進腸道鈣的重吸收,提高血鈣水平,并可通過作用于 OPG/RANKL系統,最終實現防治骨質疏松癥的作用。