嗜鹽四聯球菌對黃曲霉毒素B1生物降解的研究

張 超，李玟君，李玉蝶，汪海燕，龐子皓，肖一郎，汪 超，李 瑋

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430060）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）在生長過程中產生的一類次級代謝產物[1-2]。AFT具有極強的致癌性、致畸性和致突變性，且廣泛存在于谷物、堅果、果蔬、牛奶及肉中，1994年被國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）列為ⅠA類致癌物[3-4]。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最強，同時也是很強的誘變劑和致癌物[5-6]，是食品中最常檢測到的污染化合物之一。目前AFB1的脫毒方法主要分為物理法、化學法和生物法，其中生物法因其條件溫和、特異性好、脫毒效率高且不會對環境產生污染等優點，已成為國內外研究AFB1脫毒的熱點，如酵母菌[7]、克雷伯氏菌[8]、芽孢桿菌[9-10]等。

嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）屬乳酸菌，常見于魚露和醬油中，革蘭氏陽性菌，能從葡萄糖中產酸不產氣[11-12]。研究表明，發酵產品中添加嗜鹽四聯球菌可以促進醇、酸、酯類物質的生成，并且與苯甲醛、乙酸甲酯、乳酸乙酯、香草醛等風味物質的生成有關，此外還能降低產品中亞硝酸鹽的含量[13-15]。目前一些研究分析了乳酸菌對AFB1的脫毒情況[4，16-17]，但這些乳酸菌都不具有高鹽耐受性，無法應用于高鹽發酵食品的生產過程中。因此，為了確保發酵食品的安全性，研究耐高鹽微生物對黃曲霉毒素B1的脫毒效果是十分必要的。

本研究探討了嗜鹽四聯球菌不同組分對AFB1的降解效果，觀察了嗜鹽四聯球菌在有無AFB1毒素環境中的生長情況和微觀形態，以期為生物法降解黃曲霉毒素B1提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）：保藏于湖北工業大學湖北省食品發酵技術研究中心。

黃曲霉毒素B1標準品（純度＞98%）：天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich有限公司；酵母提取物（生化試劑）：英國Oxoid公司；牛肉浸膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養基制品廠；吐溫-80、檸檬酸氫二銨、硫酸錳：上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純）：德國BioFroxx公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

MRS液體培養基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、乙酸鈉0.3%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、牛肉膏1%、吐溫-80 0.1%。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫療核子儀器廠；HPLC-1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：國華電器（試驗）有限公司；AB-50電子分析天平：瑞士Mette公司；GNP-9160BS-Ⅲ恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造公司；WFJ2000紫外可見分光光度計：上海龍尼柯儀器設備有限公司；JSM-6390LV掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社；OMNI BeadRuptor24 Elite多功能樣品均質器組織研磨器：美國OMNI Internatio-nal公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 嗜鹽四聯球菌的活化

將-80 ℃保藏的嗜鹽四聯球菌接種于MRS液體培養基中，于37 ℃、180 r/min活化24 h，傳代兩次后，備用。

1.3.2 嗜鹽四聯球菌接種量對AFB1降解率的影響

將嗜鹽四聯球菌按1%、3%、6%、9%（V/V）的接種量分別接種于含10 μg/mL AFB1的MRS液體培養基中，暗處分別培養0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時取樣，計算樣品中AFB1的降解率。以含10 μg/mL AFB1的MRS液體培養基作為空白對照。

1.3.3 嗜鹽四聯球菌對不同濃度AFB1降解率的影響

將嗜鹽四聯球菌按1%（V/V）的接種量分別接種于含4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL AFB1的MRS液體培養基中，將其置于暗處培養，分別在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時取樣，計算樣品中AFB1的降解率。以含相同濃度AFB1的MRS液體培養基作為空白對照。

1.3.4 嗜鹽四聯球菌上清液、菌懸液和胞內液對AFB1降解率的測定

參考RAO K R等[10]的方法稍作修改。將1.3.1活化后的菌轉接培養48 h后，培養液于4 ℃、9 000 r/min離心20 min收集上清液，用無菌磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.0）清洗菌體沉淀物3次后重新懸于無菌PBS中，制得菌懸液備用。取部分菌懸液進行細胞超聲破碎，于4 ℃、9 000 r/min離心20 min，經0.22 μm無菌濾膜過濾，制得菌株胞內液備用。

將上述上清液、菌懸液和胞內液分別加入10 μg/mL的AFB1，避光培養72 h后，測定AFB1的降解率。以無菌PBS和MRS液體培養基中分別加入同質量濃度的AFB1為空白對照。

1.3.5 不同變性處理對嗜鹽四聯球菌上清液降解AFB1的影響

取無細胞上清液分別作如下處理：100 ℃沸水浴處理20 min；0.1 mol/L EDTA處理1 h；1 mg/mL蛋白酶K在50 ℃條件下處理1 h；1%SDS和1 mg/mL蛋白酶K在50 ℃條件下混合處理1 h。處理結束后，分別向每個處理組中加入10 μg/mL的AFB1，避光培養72 h。以含10 μg/mL AFB1的MRS液體培養基為空白對照。

1.3.6 金屬離子對嗜鹽四聯球菌無細胞上清液降解AFB1的影響

在含10 μg/mLAFB1的無細胞上清液中，分別加入100 mmol/L的Li+（LiCl）、K+（KCl）、Ca2+（CaCl2）、Mg2+（MgCl2）、Zn2+（ZnCl2）、Cu2+（CuCl2）、Fe3+（FeCl3）、Al3+（AlCl3）、Ba2+（BaCl2）和Mn2+（MnCl2）混合均勻，以添加相同濃度的金屬離子和AFB1的無菌MRS液體培養基為空白對照，避光培養72 h，測定其降解率。

1.3.7 形態學觀察

嗜鹽四聯球菌按1%（V/V）的接種量接于含10 μg/mL AFB1的MRS液體培養基中，以不含AFB1的菌株接種量相同的菌株培養液作為空白對照，共培養72 h后，分別于4 ℃、9 000 r/min離心20min，棄去上清液，菌體用PBS（pH7.2）洗滌3次，取一滴菌體重懸液滴加在平整的錫箔紙上烘干，4 ℃條件下用2.5%的戊二醛溶液固定4 h以上，完成后吸出多余固定液，隨后用梯度乙醇溶液（30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）進行洗脫，15 min/次，洗脫完成后靜置過夜，電鏡掃描觀察并拍攝。

1.3.8 測定方法

AFB1降解率的測定參考MAO J等[18]的方法并稍作修改，高效液相色譜法條件：色譜柱為YMC-Triart C18柱（5 μm，4.6 mm×15 cm）；流動相為甲醇∶水=70∶30（V/V）；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測器為紫外檢測器；檢測波長365 nm。AFB1降解率計算公式如下：

1.3.9 數據處理

試驗結果采用Origin 9.6、SPSS 22.0軟件對試驗數據進行處理，每個處理組進行3次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 嗜鹽四聯球菌不同接種量對AFB1降解率的影響

由圖1可知，嗜鹽四聯球菌接種量的變化對AFB1降解率有顯著影響。當接種量為9%時，24 h后AFB1的降解率趨于穩定，72 h時達到了最大降解率81.65%，隨著接種量的降低，AFB1的降解率明顯降低；當接種量為1%時，菌株對AFB1仍具有較高的降解活性，72 h后AFB1降解率為70.11%。在渾濁紅球菌PD630對AFB1的降解研究中，發現了類似的情況，隨著接種量的增加，降解速率加快[19]。

圖1 嗜鹽四聯球菌不同接種量對AFB1降解率的影響Fig.1 Effect of different Tetragenococcus halophilus inoculum on AFB1 degradation rate

2.2 不同質量濃度AFB1對嗜鹽四聯球菌降解效果的影響

由圖2可知，嗜鹽四聯球菌對不同質量濃度AFB1的降解率存在差異，但各組之間隨時間變化的趨勢基本一致。當AFB1質量濃度為4 μg/mL時，嗜鹽四聯球菌對AFB1降解率達到了最大值82.79%，隨著AFB1質量濃度的升高降解率開始下降，當質量濃度增大至10 μg/mL時，降解率明顯降低，其降解作用主要發生在24 h之后，最終（72 h）AFB1的降解率也隨之降低至72.12%。說明在低質量濃度的AFB1中，降解作用是一個快速的過程，隨著濃度的增加，降解過程明顯變慢。在張銘[20]的研究中發現，短黃桿菌3J2MO對不同質量濃度的AFB1降解率存在明顯差異，當AFB1質量濃度為1000ng/mL時，降解率明顯降低。

圖2 不同濃度AFB1對嗜鹽四聯球菌降解效果的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AFB1 on Tetraphylococcus halophila degradation rate

2.3 嗜鹽四聯球菌胞內液、菌懸液和上清液對黃曲霉毒素B1的降解率

由圖3可知，嗜鹽四聯球菌無細胞上清液對AFB1的降解率明顯高于胞內液和菌懸液。上清液與AFB1共培72 h后降解率為62.59%，結果表明菌株對AFB1的脫毒機制是降解作用而非吸附作用，且參與AFB1降解作用的活性成分主要存在于上清液中。類似的，宋茂鵬等[21]從紅樹林泥土中分離的假單胞菌Pseudomonas putidaHAI2對AFB1具有較高的降解能力，且HAI2的無細胞上清液與AFB1共培24 h后降解率為71.52%。

圖3 嗜鹽四聯球菌無細胞胞內液、菌懸液和上清液對AFB1降解率的影響Fig.3 Effect of intracellular fluid acellular supernatant,and bacterial suspension of Tetragenococcus halophilus on AFB1 degradation rate

2.4 嗜鹽四聯球菌無細胞上清液及不同處理條件對黃曲霉毒素B1降解率的影響

為了確認菌株無細胞上清液對AFB1的作用，實驗比較了不同變性處理后的上清液對AFB1的降解效果。由表1可知，嗜鹽四聯球菌上清液經蛋白酶K或SDS+蛋白酶K處理后AFB1的降解率均有下降，類似的在嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[22]、紅平紅球菌（Rhodococcuserythropolis）[23]、黃曲霉ANSM068（M.fulvusANSM068）[24]、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[25]的研究中也觀察到相似的情況，結果表明上清液中存在蛋白質或酶活性成分參與了AFB1的降解。加入金屬螯合劑EDTA后，AFB1降解活性降低，說明上清液中的活性成分需要某些金屬離子的輔助。其次上清液經加熱（100 ℃）處理后，對AFB1的降解作用仍然存在，推測該活性物質具有一定的耐熱性。

表1 嗜鹽四聯球菌上清液不同處理條件對AFB1降解率的影響Table 1 Effect of different treatment conditions of Tetragenococcus halophilus supernatant on AFB1 degradation rate

2.5 金屬離子對嗜鹽四聯球菌無細胞上清液降解黃曲霉毒素B1的影響

從2.4中得出，金屬螯合劑EDTA的加入，使得上清液對AFB1的降解率明顯降低，因此為了進一步研究上清液對AFB1的降解作用，實驗使用了10種不同金屬離子探究了上清液對AFB1降解率的影響，結果見圖4。

圖4 金屬離子對嗜鹽四聯球菌上清液降解AFB1的影響Fig.4 Effect of metal ions on degradation of AFB1 in supernatant of Tetragenococcus halophilus

由圖4可知，Al3+、Ba2+、Mn2+和Ca2+都會抑制AFB1的降解，尤其是Ca2+的抑制作用最為明顯，降解率下降至40.32%，反而Zn2+的加入AFB1的降解率提高到72.52%，可能是Zn2+的加入影響了上清液中活性成分的構型，進而提高了降解率。有研究發現，銅綠色假單胞菌N17-1培養上清液對AFB1的降解中，Cu2+可提高降解率，而Mg2+、Zn2+的加入抑制了降解作用[25]。

2.6 形態學觀察

為了探究嗜鹽四聯球菌在黃曲霉毒素B1降解過程中的變化，對其微觀結構，進行了觀察結果見圖5。由圖5可知，實驗組（嗜鹽四聯球菌+AFB1）與空白組（嗜鹽四聯球菌）在×600放大倍數下，各微觀結構無明顯差異，當放大倍數的增加至×13 000時，實驗組細胞壁表面的褶皺明顯轉好。出現這種現象的原因可能是：a.嗜鹽四聯球菌對黃曲霉毒素B1環境產生了一定的適應能力；b.黃曲霉毒素B1被降解，推測AFB1與菌株細胞壁發生了結合作用[26]。

圖5 AFB1對嗜鹽四聯球菌形態的影響Fig.5 Effect of AFB1 on Tetragenococcus halophilus morphology

3 結論

本實驗主要研究了嗜鹽四聯球菌對黃曲霉毒素B1的降解特性，結果證實菌株對AFB1具有較好的脫毒效果，嗜鹽四聯球菌接種量為1%，發酵72 h時對AFB1的降解率即可達到70.11%，通過測定生長曲線發現AFB1對菌株的生長無影響，通過比較菌株各組分對AFB1的脫毒效果，發現降解作用主要發生在上清液中，經EDTA、蛋白酶K、蛋白酶K+SDS及加熱（100 ℃）處理后，降解率降低，說明參與降解作用的可能是蛋白或活性酶類物質，并且該活性成分具有良好的耐熱性。在金屬離子實驗中，Ca2+的加入會抑制AFB1的降解，而Zn2+的加入提高了AFB1的降解率。此外，還觀察了嗜鹽四聯球菌在有無AFB1毒素環境下的微觀結構，經72 h培養后，菌體表面的褶皺轉好。綜上，嗜鹽四聯球菌對AFB1具有較好的降解性，為生物法對AFB1的降解提供了參考。