產香酵母的篩選鑒定及產酯條件優化

李歡歡，曾雪瑩，謝 娟，劉 玲，徐學鋒

（華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

中國白酒的風味物質主要由酸、酯、醛和醇組成，其中酯類是白酒的第一大類風味物質，主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等，它們的含量和比例影響著白酒的風格和品質[1-2]。豉香型白酒為廣東地產白酒，其酒體玉潔冰清，豉香獨特，醇和甘滑，余味爽凈[3]。豉香型白酒采用的是半固體發酵工藝，品質容易受到季節因素的影響，相較于固態發酵白酒，其總酯含量偏低，酒體略顯淡薄，因此，增加基酒的酯含量是豉香型白酒品質提升的關鍵所在[1]。酯類物質主要來源于產酯酵母的代謝作用。產酯酵母對酸、醇有較強的酯化能力，所產生的香氣物質以酯類為主，還包括醇類、酸類、酮類、芳香族類等[4-5]，是白酒產香的主要菌種之一。自20世紀70年代以來，我國許多酒廠將純種培養產酯酵母應用于白酒生產顯著改善了酒質。如胡建華等[6]從牛欄山白酒釀造車間分離出一株高產乙酸乙酯的生香酵母，通過純種擴大培養得到的種子液，按照清香型白酒生產工藝，在入池發酵前添加1%的種子液，結果顯示，強化了生香酵母的基酒中的乙酸乙酯含量比對照組提高了109%。董士偉等[7]從豉香型白酒中產酯酵母篩選到一株產乙酸乙酯能力較高的酵母菌株，通過發酵試驗驗證，該菌株對提高豉香型白酒的基酒品質有一定效果。

本研究從自然發酵腐敗的板栗中分離酵母菌株，對其發酵產物進行產酯分析，分析其耐受性并對其發酵條件進行優化，并結合豉香型白酒基酒的發酵工藝進行產酯能力比較，以期得到產香優異的酵母菌，為該菌應用于豉香型白酒的增香提味提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生板栗：取自湖北羅田大別山，自然發酵腐敗后產生特殊香氣，用于酵母菌分離；酒餅、大米：廣東省九江酒廠有限公司。

氫氧化鈉標準滴定溶液[C（NaOH）=0.100 0 mol/L]、硫酸標準滴定溶液[C（1/2H2SO4）=0.100 0 mol/L]、體積分數40%的無酯乙醇溶液[8]；葡萄糖（分析純）：廣州化學試劑廠；其他化學試劑均為國產分析純；高峰α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min；發酵產酯培養基[9]：稱量適量大米，按照大米∶水=1∶3（體積比）的比例加水，蒸熟，加入10 U/g的α-淀粉酶，于90 ℃水浴1 h，冷卻至60 ℃，加入糖化酶80 U/g，糖化2 h，過濾。濾液5 000 r/min離心15 min，收集上清液，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UV-1100型紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SPH-2102C立式恒溫培養振蕩器：上海四平實驗設備有限公司；SPX-250B型生化培養箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

以YPD培養基為基礎，通過稀釋涂布方法從自然發酵板栗中分離酵母單株，經嗅聞篩選出具有濃烈甜香的酵母菌，純化單菌落，鏡檢觀察菌體形態，符合酵母菌落、菌體特征的單菌落純化3次，斜面于4 ℃保藏。

1.3.2 菌株種子液制備

無菌條件下將斜面保藏的菌株接種至YPD液體培養基中，28 ℃培養至對數期，利用血球板計數法調節酵母濃度為1.0×107CFU/mL。

1.3.3 菌株產酯能力篩選

將分離純化的酵母菌以2%的接種量接種至發酵產酯培養基，初始糖度為12°Bx，pH 6，28 ℃、150 r/min培養5 d，測定其產酯量。

1.3.4 生長曲線

取所篩選菌株涂布于YPD液體培養基中28 ℃、150 r/min培養，分別在0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h取發酵液測定其OD560nm值，重復3次，繪制生長曲線。

1.3.5 菌種分子生物學鑒定

將純化后菌株送往上海生工生物工程股份有限公司進行內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）測序，將序列在美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫登錄注冊，并利用基本局部比對工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行比對，初步確定菌種的分類屬性，再通過MEGA X軟件構建系統發育樹。

1.3.6 菌株耐受特性分析

（1）酒精耐受性：將種子液以5%的接種量分別接種到含有體積分數0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%無水乙醇的YPD培養基，以不接種菌的YPD液體培養基作為空白對照，在28 ℃培養32 h，測定發酵液的OD值差值（OD560nm-OD560nm（空白）值）。

（2）乳酸耐受性：將種子液以5%的接種量分別接種到含有0、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L乳酸的YPD培養基，以不接菌的YPD液體培養基作為空白對照，在28 ℃培養32 h，測定發酵液的OD值差值（OD560nm-OD560nm（空白）值）。

1.3.7 產酯量的測定

取適量發酵液進行常壓蒸餾，取50 mL餾分，利用皂化回流法[9]測定產酯量。

1.3.8 發酵產酯條件優化單因素試驗

接種量的優化：將種子液分別以2%、3%、4%、5%、6%的接種量接入初始糖度12°Bx，pH6的產酯培養基中，裝液量為40%，28 ℃、150 r/min培養5 d，測定發酵液的產酯量。

初始糖度的優化：將種子液以2%的接種量接入初始糖度分別為6°Bx、9°Bx、12°Bx、15°Bx、18°Bx，pH6的產酯培養基中，裝液量為40%，28 ℃、150 r/min培養5 d，測定發酵液的產酯量。

搖床轉速的優化：將種子液以2%的接種量接種于初始糖度12°Bx，pH 6的產酯發酵培養基中，裝液量為40%，分別設置搖床轉速為0（靜置）、50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min，28 ℃條件下培養5 d，測定發酵液的產酯量。

裝液量的優化：將種子液以2%的接種量接種于初始糖度12°Bx，pH 6的產酯發酵培養基中，裝液量分別為20%、30%、40%、50%、60%，28 ℃、150 r/min培養5 d，測定發酵液的產酯量。

1.3.9 發酵產酯條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取接種量（A）、初始糖度（B）、搖床轉速（C）、裝液量（D）為考察因素，以產酯量為評價指標，設計L9（34）正交試驗優化發酵產酯條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 酵母H32發酵產酯條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels for orthogonal tests optimization of yeast H32 fermentation conditions for ester production

1.3.10 產酯酵母半固態發酵釀酒試驗

參照豉香型白酒發酵工藝[10]，稱取75 g大米，添加純水75 mL，蒸熟糊化，補加150 mL純水，冷卻至室溫，對照組只添加15 g酒餅，試驗組除了加15 g酒餅外，再接種分別接種1%、3%、5%、7%、9%的產酯酵母H32（107CFU/mL），30 ℃培養15 d，測定產酯量。

1.3.11 數據處理

利用Excel 2010 軟件整理基礎數據，整理后的數據通過SPSS 20.0軟件進行方差分析，用Origin 2020進行數據分析作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌形態及培養特征

經一系列篩選后共分離得到5株疑似酵母菌（編號為H32、7d1、H28、H4、7d5），以菌株H32為例，觀察其菌落及細胞形態，結果見圖1。由圖1可知，經分離的酵母單菌落為乳白色，菌落質地均勻，菌落表面濕潤、光滑、黏稠，易挑起，菌體為橢圓形，出芽生殖，經嗅聞培養皿富有強烈甜香，與酵母菌的基本特征符合[11-12]。

圖1 菌株H32菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain H32

2.2 產酯能力篩選

將初步分離的5株疑似酵母菌株進行產酯能力復篩，比較產酯量，結果見圖2。由圖2可知，菌株H32、7d1產酯量均超過0.40 g/L，其中菌株H32產酯量最高，為0.64 g/L。因此選擇菌株H32、7d1進行后續試驗。

圖2 不同菌株產酯量比較Fig.2 Comparison of ester production by different strains

2.3 酵母菌株生長曲線

菌株H32和7d1置于YPD培養基中培養的生長曲線見圖3。由圖3可知，菌株H32和7d1在培養4 h后進入對數生長期，在對數生長期，菌株H32的生長速率略高于菌株7d1，在培養32 h時，菌株H32進入穩定期[13-16]，且菌株H32達到穩定期的峰值高于菌株7d1，因此選擇菌株H32作為下一步試驗對象。

圖3 菌株H32和7d1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strains H32 and 7d1

2.4 酵母菌的分子鑒定結果

對菌株的ITS序列進行測序，數據在NCBI數據庫登錄，序列號為OL635985，經BLAST比對，然后用MEGA-X軟件繪制菌株H32基因序列相關菌株的系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株H32與EU809443.1Debaryomyces hansenii聚在一個分支上；再結合菌落形態、鏡檢結果分析，確定菌株H32為漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）。

圖4 基于ITS基因序列菌株H32的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain H32 based on ITS gene sequences

2.5 酵母菌H32耐受性測定

2.5.1 酒精耐受性

由圖5可知，在乙醇含量為8%的條件下，酵母呈現微弱生長；當乙醇含量＞8%時，酵母生長受到強烈抑制，菌種不生長；因此具有耐受8%乙醇的能力。張莉等[16]認為耐酒精能力強的酵母菌株可以使發酵更加完全、徹底。而酵母H32具有一定的酒精耐受特性，使其在白酒發酵中可維持良好的生存狀態，積累更多的香味物質。

圖5 酵母H32的酒精耐受性Fig.5 Alcohol tolerance of yeast H32

2.5.2 乳酸耐受性

由圖6可知，在乳酸含量為25 g/L時，酵母H32依舊呈現微弱生長；而當乳酸含量為30 g/L時，酵母H32受到乳酸的顯著抑制，菌體不生長；因此具有耐受25 g/L乳酸的能力，換算成pH值為2.2左右。在酒類釀造工程中，乳酸菌和酵母菌是最為龐大的兩個微生物群體[17]。兩者之間存在相互作用，熊君燕等[18]研究發現，酵母菌與乳酸菌共培養時，酵母菌受到了一定程度的抑制，是由于乳酸菌產酸創造的酸性環境，因此得到一株耐酸性強的酵母菌株至關重要。

圖6 酵母H32的乳酸耐受性Fig.6 Lactic acid tolerance of yeast H32

2.6 酵母H32發酵產酯條件的單因素試驗優化

2.6.1 裝液量對酵母H32產酯量的影響

由圖7可知，隨著裝液量的增加，酵母H32的發酵產酯量呈現先上升后下降的趨勢；裝液量為40%時，產酯量最高，為0.84 g/L，表明裝液量顯著影響發酵過程中的氧氣供應情況，從而影響其產酯量。裝液量過小，導致培養基的水分蒸發較快，溶氧下降；而裝液量過大導致振蕩效果減弱，溶氧降低[19-20]。因裝液量為50%時，產酯量與裝液量40%時差異不顯著（P＞0.05），因此選擇裝液量30%、40%、60%進行后續正交試驗。

圖7 裝液量對酵母H32產酯量的影響Fig.7 Effect of liquid volume on the ester production of yeast H32

2.6.2 搖床轉速對酵母H32產酯量的影響

由圖8可知，隨著搖床轉速的增加，酵母H32的發酵產酯量呈現先緩慢上升后下降的趨勢；搖床轉速為100 r/min時，產酯量最高，為0.64 g/L。表明搖床轉速顯著影響發酵過程中的溶氧量，從而影響其產酯量。搖床轉速過高，氣體停留時間縮短從而使得溶氧降低，同時剪切力過大，不利于產酯；搖床轉速過小影響溶氧量，亦不利于產酯[21-23]。因此選擇搖床轉速為100 r/min為宜。

圖8 轉速對酵母H32產酯量的影響Fig.8 Effect of rotation speed on the ester production of yeast H32

2.6.3 接種量對酵母H32產酯量的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，酵母H32的發酵產酯量呈現先上升后下降的趨勢；接種量為4%時，產酯量最高，為0.74 g/L。表明接種量顯著影響產酯量，接種量過高，培養基營養物質有限，菌體密度過高，使得菌體營養供給不足；接種量過低，菌種密度低，繁殖速度較慢[24]。因此，選擇接種量4%為宜。

圖9 接種量對酵母H32產酯量的影響Fig.9 Effect of inoculum on the ester production of yeast H32

2.6.4 初始糖度對酵母H32產酯量的影響

由圖10可知，隨著初始糖度的增加，酵母H32先上升后持續下降；初始糖度為9°Bx時，產酯量最高，為1.16 g/L，表明初始糖度顯著影響酵母菌的碳源，從而影響其產酯量。初始糖度過低，會減弱酵母菌代謝轉化[25]；糖度過高，同樣會導致高滲透壓，從而影響產酯。因此，選用初始糖度為9°Bx為宜。

圖10 初始糖度對酵母H32產酯量的影響Fig.10 Effect of initial sugar contents on the ester production of yeast H32

2.7 酵母H32發酵產酯條件的正交試驗優化

根據單因素試驗優化的結果，選擇接種量（A）、初始糖度（B）、搖床轉速（C）及裝液量（D）4個因素進行正交試驗，考察其交互作用對酵母H32產酯量的影響，優化產酯工藝條件，正交試驗結果與分析見表2。由表2可知，4個因素的影響效應依次為C＞D＞B＞A，產酯條件的最佳組合為A3B2C1D3，即接種量5%、初始糖度9 °Bx、搖床轉速為50 r/min、裝液量為60%，在此條件下，酵母H32產酯量達1.170 g/L。

表2 酵母H32發酵產酯條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for optimization of yeast H32 fermentation conditions for ester production

正交設計結果方差分析見表3。由表3可知，4個影響因素的平方和均小于0.5，表明該數據的性質穩定，試驗數據可信度高，自由度均為2，F值均不接近于1，表明組間差異較大，具有統計學意義，并且4個影響因素對結果均具有顯著性影響（P＜0.05）。

表3 正交設計結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.8 產酯酵母模擬發酵釀酒試驗

以不同比例接種酵母H32進行豉香型白酒模擬釀酒試驗，結果如圖11所示。

圖11 酵母H32接種量對白酒中總酸（a）和總酯（b）含量的影響Fig.11 Effect of yeast H32 inoculum on total acid(a) and total east (b) contents in Baijiu

由圖11可知，當酵母H32的接種量為3%時，總酸量最高，為0.47 g/L，且差異顯著（P＜0.05）。產酯量方面，以不同比例接種酵母H32與對照組相比差異顯著（P＜0.05），酵母H32的接種量為1%時，產酯量最高達0.940 g/L，是對照組的6.71倍，且處理組之間具有顯著性差異（P＜0.05），表明不同添加量的產酯酵母在發酵過程中受到了內部環境因素的影響，導致產酯量有所變化?？偟膩碇v，將產酯酵母應用于豉香型白酒半固態發酵過程中，有效的提升了基酒的產酯量。

3 結論

單因素及正交試驗結果表明，裝液量和初始糖度對產酯酵母H32的總酯含量影響較大，接種量與轉速影響較小。優化后的產酯酵母H32菌株的發酵最優條件為接種量5%、初始糖度9°Bx、轉速50 r/min、裝液量為60%，該條件下產酯酵母H32的產酯量為1.170 g/L。通過模擬半固態發酵釀酒試驗，發現該產酯酵母H32菌株的接種量為1%時，基酒中產酯量是對照組（0.140 g/L）的6.71倍，達到0.940 g/L，說明應用產酯酵母提升豉香型白酒酒質具有重大意義，結果為豉香型白酒進一步的生產實踐提供了理論依據。