來賓酒糟酸菜中降膽固醇乳酸菌的篩選鑒定及發酵工藝研究

陳顯玲，農秀麗，盧麗婷，楊福川，麥雪蘭，黃安甲，蘇 龍，2*

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119；2.廣西糖資源工程技術研究中心，廣西 來賓 546119）

隨著社會的發展與進步，人們的生活水平不斷的提高，加之工作生活節奏的加快、膳食營養的過剩及運動的缺乏，導致越來越多的人的血清中膽固醇含量偏高，過量的膽固醇攝入會導致心腦血管各類疾病的發生[1-2]。世界衛生組織預測，未來幾十年心血管疾病仍然是威脅人類生命安全的疾病之一，而高膽固醇是引發該疾病的重要因素之一[3]。目前，藥物治療是高膽固醇血癥患者采用的主要治療方法，但藥物治療費用高，且存在副作用[4]。因此，從我國傳統發酵乳酸菌食品中發掘安全、高效降膽固醇的食品成為研究熱點，對于預防和輔助治療高膽固醇血癥具有重要的意義。

有研究表明，經常食用乳酸菌發酵食品可降低人體血液中的膽固醇含量，進而降低心血管疾病發生的幾率[5]。傳統發酵食品是乳酸菌的主要來源，馬長路等[6]從東北酸菜中分離純化出10株乳桿菌，其中干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的膽固醇降解率達到52.84%；國立東等[7]從東北酸菜中分離純化出一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）HUCM115，膽固醇去除率達20.6%；任大勇等[8]從東北黏面子、辣白菜、辣醬分離純化出6株乳酸菌，膽固醇清除率達到85%以上；李雅迪等[9]從傳統發酵食品中分離篩選出一株Lactobacillus plantarumS11，膽固醇降解率達44.34%；云月英等[10]從發酵肉制品中獲得彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），膽固醇去除率分別為56.05%和58.49%。此外，國內也有報道不同來源的益生菌在膽固醇降解方面的應用[11-20]。

酒糟酸菜作為廣西來賓地區的一種傳統發酵蔬菜，以其特殊的制作工藝而出名，且營養豐富、酸脆可口、解膩開胃，是來賓地區餐桌上常見的菜品。本研究從來賓市場的酒糟酸菜中分離篩選具有去除膽固醇能力的乳酸菌，通過形態觀察和分子生物學技術對其進行菌種鑒定，同時研究其耐酸性及耐膽鹽性，并以膽固醇去除率為考察指標，通過單因素試驗及正交試驗對其發酵工藝進行優化，探究其體外膽固醇降解能力，旨在豐富降膽固醇益生菌菌種資源庫，也為傳統益生菌功能食品的開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酸菜汁：采自廣西來賓市場酒糟發酵酸菜汁，于-20 ℃保存備用。

1.1.2 培養基MRS液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

MRS-CaCO3培養基[21]：在MRS液體培養基的基礎上添加2%的瓊脂和1%的CaCO3，調節pH為6.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS-膽固醇（cholesterol，CHOL）培養基[22]：稱取0.1 g膽固醇，0.2 g牛膽鹽，0.1 g蔗糖酯，加入1 mL吐溫80，攪勻，再加入5 mL冰乙酸，超聲振蕩至完全溶解，趁熱用0.45 μm的濾膜過濾，加入1 L MRS液體培養基中，調pH至6.0～7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

牛膽鹽、膽固醇（純度均為99%）：合肥博美生物科技有限責任公司；冰乙酸、氯化鈉、鄰苯二甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、正己烷等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV1050紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；PHS-3E pH計：上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；ZSD-1090型生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的分離[22]

采用生理鹽水將酸菜汁進行10倍梯度稀釋，分別吸取稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液100 μL均勻涂布于MRSCaCO3固體培養基平板上，于37 ℃條件下厭氧培養48 h。挑取具有明顯溶鈣圈的單菌落劃線于MRS固體培養基中進行分離純化至菌落形態單一，將純化后的菌株于4 ℃保存備用。

1.3.2 降膽固醇乳酸菌菌株的篩選[23]

將分離得到的菌種置于MRS液體培養基中，于37 ℃條件下培養12～14 h，進行活化。按3%（V/V）的接種量將活化的菌種接種到MRS-CHOL培養基中，于37 ℃條件下培養72 h后測定膽固醇含量[24-25]，并計算膽固醇去除率，其計算公式如下[26-27]：

式中：A為空白MRS-CHOL培養基中的膽固醇含量，μg/mL；C為菌株培養72 h后膽固醇的含量，μg/mL。

1.3.3 降膽固醇菌株的鑒定

形態觀察：將篩選菌株劃線接種于MRS培養基平板上，于37 ℃條件下培養48 h，觀察菌落形態。通過革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體細胞形態特征。

分子生物學鑒定：將篩選得到的菌種委托上海美吉生物醫藥科有限公司進行測序，將測序得到的結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹[28]。

1.3.4 菌株的耐酸性試驗[6]

將活化的菌株按4%（V/V）的接種量接種于pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0的MRS液體培養基中，以接種于pH值為6.0的MRS液體培養基為對照，37 ℃條件下靜置培養24 h，試驗重復3次，測定各培養液的OD600nm值，并計算菌株存活率，其計算公式如下：

式中：B、B0分別為試驗組和對照組培養液的OD600nm值。

1.3.5 菌株的耐膽鹽性試驗[6]

將活化的菌株按4%（V/V）的接種量接種于膽鹽含量分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養基中，以接種于不加膽鹽的MRS液體培養基為對照組，37 ℃條件下靜置培養24 h，試驗重復3次，測定各培養液的OD600nm值，并計算菌株存活率，其計算公式如下：

式中：C、C0分別為試驗組和對照組培養液的OD600nm值。

1.3.6 篩選菌株去除膽固醇培養條件優化

發酵初始條件為初始pH值6.0、發酵溫度37 ℃、接種量4%、發酵時間36 h。

單因素試驗：采用控制變量法[29]，以膽固醇去除率為考察指標，考察初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發酵時間（36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）和發酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）4個因素對篩選菌株去除膽固醇的影響。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，以膽固醇去除率為考察指標，初始pH值（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）為考察因素進行4因素4水平正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 菌株去除膽固醇培養條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments optimization of strain culture conditions for removing cholesterol

1.3.7 數據處理

作圖和數據處理采用Origin 8.5軟件進行。

2 結果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌菌株的分離及篩選

將酸菜汁稀釋涂布于MRS-CaCO3固體培養基中，培養48 h后，分離得到20株有明顯溶鈣圈的菌株，其中膽固醇去除率＞15%的菌株有5株，其膽固醇去除率見表2。

表2 篩選菌株的膽固醇去除率Table 2 Cholesterol removal rates of selected strains

由表2可知，菌株XL-02的膽固醇去除率最高，為（21.3±1.4）%，菌株XL-03次之（17.6±1.1）%，所以后續試驗以菌株XL-02作為研究對象。

2.2 菌株XL-02的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株XL-02在MRS培養基平板上的菌落形態及細胞形態見圖1。

圖1 菌株XL-02的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain XL-02

由圖1可知，菌株XL-02的菌落表面圓滑，形態較小，呈乳白色凸起狀的菌落；在光學顯微鏡下觀察菌株呈短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色為陽性。

2.2.2 分子生物學鑒定

基于16SrDNA基因序列菌株XL-02的系統發育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株XL-02的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain XL-02 based on 16S rDNA gene sequence

由圖2可知，菌株XL-02與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）16S rDNA基因序列同源性達100%，聚于一支，親緣關系最近，因此確定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 菌株XL-02的耐酸性試驗結果

菌株XL-02的耐酸性試驗結果見圖3。

圖3 菌株XL-02的耐酸性試驗結果Fig.3 Acid tolerance tests results of strain XL-02

益生菌要發揮益生功能必須定殖于腸道中，必須具有耐受胃部強酸環境的能力[30]。由圖3可知，菌株XL-02在pH 2.0和pH3.0的環境下培養24 h，存活率分別為3.14%和5.65%，而在pH4.0和pH5.0的環境下培養24 h后存活率分別達到18.31%和20.25%，說明菌株XL-02的耐酸性較好，能夠耐受胃部的強酸性環境，可以進入腸道。

2.4 菌株XL-02的耐膽鹽性試驗結果

菌株XL-02的膽鹽耐受性試驗結果見圖4。

圖4 菌株XL-02的膽鹽耐受性試驗結果Fig.4 Bile salt tolerance tests results of strain XL-02

由圖4可知，當膽鹽含量為0.3%時，菌株XL-02培養24 h后，存活率達到12.17%，表明該菌株對膽鹽具有較強的耐受性，說明菌株XL-02在人體腸道膽鹽含量為0.03%～0.3%的環境中可以存活并增殖[31-32]。

2.5 菌株XL-02降膽固醇培養條件優化單因素試驗結果

2.5.1 初始pH值對菌株XL-02去除膽固醇的影響

初始pH值對菌株XL-02去除膽固醇的影響結果見圖5。

圖5 初始pH對菌株XL-02去除膽固醇的影響Fig.5 Effect of initial pH on cholesterol removal by strain XL-02

有研究表明，初始pH影響培養基成分的解離，也影響菌株細胞膜的帶電情況，進而影響菌株對營養成分的吸收，最終影響菌株的生長和代謝情況[33]。由圖5可知，當初始pH值＜6.0之前，隨著初始pH值的升高，菌株XL-02對膽固醇的去除率逐漸增加；當初始pH值為6.0時，膽固醇去除率最高，達到46.53%；當初始pH值繼續升高，膽固醇去除率開始下降，原因可能是pH影響到菌株膽鹽水解酶的分泌[1]。故確定最適初始pH值為6.0。

2.5.2 接種量對菌株XL-02去除膽固醇的影響

接種量對菌株XL-02去除膽固醇的影響結果見圖6。

圖6 接種量對菌株XL-02去除膽固醇的影響Fig.6 Effect of inoculum on cholesterol removal by strain XL-02

由圖6可知，當接種量＜4%之前，隨著菌株XL-02接種量的增加，膽固醇的去除率也增加；當接種量為4%時，膽固醇去除率最高，可達46.51%；當接種量進一步增加時，膽固醇去除率反而降低。分析原因可能是接種量的多少，影響微生物進入快速生長期的快慢，但接種量過高時，養分消耗過快，菌種老化速度加快，產生自溶，影響到代謝產物的分泌[34]。故確定最適接種量為4%。

2.5.3 發酵時間對菌株XL-02去除膽固醇的影響

發酵時間對菌株XL-02去除膽固醇的影響結果見圖7。

圖7 發酵時間對菌株XL-02去除膽固醇的影響Fig.7 Effect of fermentation time on cholesterol removal by strain XL-02

由圖7可知，當發酵時間36～72 h時，隨著發酵時間的延長，膽固醇去除率的逐漸增加；當發酵時間為72 h時，膽固醇去除率達到最大，為51.41%；當發酵時間繼續延長，膽固醇去除率開始下降。分析原因可能是培養時間不僅影響菌株的生長速率和生長量，且影響菌種代謝產物的多少；菌種在生長初期數量少，隨后大量繁殖，膽固醇去除率快速增加；發酵后期，營養成分剩余量較少，菌種代謝營養需求得不到滿足，導致部分菌種衰亡[35-36]。故確定最適發酵時間為72 h。

2.5.4 發酵溫度對菌株XL-02去除膽固醇的影響

發酵溫度對菌株XL-02去除膽固醇的影響見圖8。

圖8 發酵溫度對菌株XL-02去除膽固醇的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on cholesterol removal by strain XL-02

溫度影響微生物的生長，溫度低菌株生長繁殖慢，代謝產物分泌延遲；溫度高則生長啟動快，但營養成分消耗快，發酵周期縮短[37]。由圖8可知，隨著發酵溫度的升高，膽固醇去除率呈先升高后下降的趨勢，當發酵溫度為39 ℃，發酵36 h時，膽固醇去除率最高，達到48.77%。故確定最適發酵溫度為39 ℃。

2.6 菌株XL-02去除膽固醇培養條件優化正交試驗結果

發酵條件優化正交試驗結果與分析見表3，方差分析結果見表4。

表3 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal tests results

由表3及表4可知，對菌株XL-02去除膽固醇能力影響因素的次序為A＞D＞B＞C，即初始pH值＞發酵時間＞接種量＞發酵溫度。其中因素A（初始pH）對結果影響極顯著（P＜0.01），因素B（接種量）和因素D（發酵時間）對結果影響顯著（P＜0.05），因素C（發酵溫度）對結果影響不顯著（P＞0.05）。由表3亦可知，菌株XL-02去除膽固醇的最優培養條件組合為A2B3C3D3，即初始pH值6.0，接種量4%，發酵溫度39 ℃，發酵時間72 h。在此最優條件下，膽固醇去除率最高達（61.56±0.08）%，高于試驗組3的去除率（56.43%）。

3 結論

本研究采用鈣溶圈法及MRS-膽固醇培養基從廣西來賓酒糟酸菜汁中分離篩選出一株膽固醇去除能力較高的乳酸菌菌株，編號為XL-02，通過形態觀察及分子生物學技術鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），具有較好的耐酸能力和膽鹽耐受性，在pH2.0的酸性環境下培養24 h，菌株存活率為3.14%；在膽鹽含量為0.3%條件下培養24 h，菌株存活率為12.17%。通過單因素和正交試驗確定菌株XL-02去除膽固醇的最優發酵條件為：以MRS液體培養基為發酵培養基，初始pH值6.0，接種量4%，發酵溫度39 ℃，發酵時間72 h。在此最優條件下，膽固醇去除率最高達（61.56±0.08）%。本研究為豐富益生菌種質資源提供新的候選菌株，為發展地方特色發酵蔬菜的工業化生產提供科學依據。