培養基與分割發酵優化促進Nisin生物合成

劉月鋒，馮碧純，喬靖宇，熊華儀，陳 雄，李 沛，李 庫，唐冠群，王 志*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室 湖北省工業發酵協同創新中心，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司 酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）等菌株產生的抗菌肽，對大多數革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌存在顯著抑制作用[1-2]，因其在生物體內易于降解，因而不會引起生物耐藥性，被公認為安全無毒的天然食品添加劑[3]。

Nisin是由34個氨基酸組成的多肽[4]，屬于次級代謝產物，但其合成卻顯示出初級代謝的特征并與細胞生長耦聯[5-6]，因而Nisin高效合成依賴于較高的菌體密度[7]。作為兼性厭氧菌，乳球菌三羧酸循環不完整，糖酵解是主要的能量生成途徑[8]，因而其糖代謝產能效率并不高，細胞生物量合成所需營養分子基本來自環境吸收或吸收后進一步合成，而非由糖代謝從頭合成[9]。另外，乳球菌糖代謝為同型乳酸發酵[10]，乳酸積累導致pH下降和酸脅迫效應[11]，進而抑制糖酵解效率、細胞生長和Nisin合成效率[12]。因而，發酵后期菌體停止生長甚至自溶的原因是酸脅迫以及Nisin對細胞代謝活性的抑制[13]，而不僅僅是營養耗損[14]，乳球菌有限的生物量和耐酸能力嚴重限制了其Nisin的生產能力[15]。乳球菌還是多種維生素、氨基酸的營養缺陷型[16]，并不能同化無機氮源。該菌株具有復雜的蛋白水解系統[17]，包括蛋白酶、氨基酸和肽轉運蛋白以及胞內肽酶[18]，而且菌株間蛋白水解能力以及對氮源的利用能力存在較大差異[19]。

為了提高乳球菌細胞生長和Nisin合成效率，本研究通過正交試驗優化發酵培養基，并在搖瓶培養的基礎上，進行10 L發酵罐分批發酵驗證試驗，考察能快速啟動細胞生長和產物合成的分割發酵模式[20]對Nisin合成的影響，確定最適分割發酵工藝，為發酵生產Nisin提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）：本實驗室保藏。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；玉米漿、蔗糖（均為食用級）：市售；三水合磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸三銨、輕質碳酸鈣、濃硫酸、稀鹽酸、蒽酮（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Nisin標準品（1 000 IU/mg）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養基

斜面種子培養基：1.5%胰蛋白胨，1.5%酵母浸粉，1.5%牛肉膏，1%葡萄糖，1%乙酸鈉，0.2%磷酸氫二鈉，0.2%檸檬酸三銨，1%輕質碳酸鈣，2%瓊脂，pH 6.8。

初始發酵培養基：4%蛋白胨，2%蔗糖，1%玉米漿，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質碳酸鈣，pH 6.8。

發酵培養基：3%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%蔗糖，1%玉米漿，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質碳酸鈣，pH 6.8。

平板計數培養基：2%酵母浸膏，0.5%氯化鈉，2%瓊脂，pH 7.4～7.5。

上述培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SPX-150D恒溫生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；V-1300可見分光光度計：上海美析儀器有限公司；HNV-211B恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：湖北鼎泰高科有限公司；S-10生物傳感器分析儀：深圳市西爾曼科技有限公司；CJ-2D無菌操作臺：天津泰斯特儀器有限公司；10 L機械攪拌通風發酵罐：上海保興生物設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

-80 ℃冰箱保存的乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）甘油管接斜面種子培養基的平板，30 ℃培養24 h后轉接茄子瓶（裝液量為60 mL/250 mL），30 ℃培養24 h，無菌操作加入60 mL無菌水，并用無菌竹簽將菌苔挑起混合于無菌水中，得到種子液，備用。

1.3.2 溫度和不同氮源對乳酸乳球菌生物量的影響

在28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃條件下，分別考察4%蛋白胨（單一氮源）、3%蛋白胨和1%酵母浸粉（復合氮源）對細胞生長代謝的影響。

1.3.3 發酵培養基配方優化正交試驗

在前期單因素試驗的基礎上，選擇培養基成分中蛋白胨（A）、蔗糖（B）、玉米漿（C）添加量為影響因素進行L9（33）正交設計試驗，分別以乳酸乳球菌生物量以及Nisin效價為考察指標，確定最佳發酵培養基。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of fermentation medium formula

1.3.4 搖瓶培養及10 L發酵罐分批發酵驗證試驗

以生物量以及Nisin效價為評價指標，采用優化培養基搖瓶培養，并在此基礎上進行10 L發酵罐分批發酵驗證試驗。

搖瓶培養：裝液量為50 mL/250 mL發酵培養基，每瓶接種種子液0.45 mL。置于30 ℃搖床間歇振蕩培養12 h（每小時200 r/min運轉30 s后，轉速調為0 r/min）。

10 L發酵罐分批發酵：10 L發酵罐中裝7 L發酵培養基，接種60 mL種子液，30 ℃、100 r/min不通氣培養20 h。

1.3.5 分割發酵

分割發酵指分批發酵達到一定程度后放料，并補加等量新鮮培養基繼續培養的發酵方式，其具有快速啟動細胞生長和產物合成的優勢[20]。分割發酵過程為：使用優化后發酵培養基在10 L發酵罐進行分批發酵（具體條件同1.3.4），Nisin效價達到峰值（0～18 h）后放料，放料體積比例為70%、75%、80%、85%（罐內保留體積比例為30%、25%、20%、15%），后通氮氣（為兼性厭氧菌的乳酸乳球菌提供快速啟動生長的厭氧環境）30 min的同時接入發酵培養基，定容至7 L，繼續按30 ℃、100 r/min不通氣培養。

1.3.6 分析檢測

生物量（以細胞數計）測定：稀釋涂布平板法[21]；菌體對基質消耗的得率系數（Yx/s）=生物量（108CFU/mL）/達到該時間點的總糖消耗量（g/L）；總糖（以蔗糖計）測定：硫酸-蒽酮法[22]；乳酸測定：生物傳感儀[23]；Nisin平均合成速率=Nisin效價（IU/mL）/達到該效價時的發酵時間（h）；產物對菌體的得率系數（Yp/x）=Nisin效價（IU/mL）/達到該時間點的最大生物量（108CFU/mL）。

Nisin效價測定：采用HPLC法。具體方法如下：

（1）樣品處理

發酵液用鹽酸稀釋至一定的倍數，pH在2.0～2.7之間[24]，12 000 r/min離心20 min，經0.45 μm濾膜過濾后備用。

（2）Nisin標準液制備以及標準曲線的繪制

稱取0.25 g Nisin標準品于50 mL容量瓶中，以0.01 mol/L的鹽酸溶液（pH2.0）定容，得到Nisin標準工作液（5000IU/mL）。準確吸取標準工作液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL至10mL容量瓶中，并用0.01 mol/L的鹽酸溶液（pH2.0）定容。得到系列Nisin標準液，其乳酸鏈球菌素標準溶液的最終效價分別為1 000 IU/mL、2 000 IU/mL、3 000 IU/mL、4 000 IU/mL、5 000 IU/mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣，以Nisin效價（x）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制Nisin標準曲線。

（3）色譜條件

流動相為水和乙腈以81∶19（V/V）混溶（加入0.05%三氟乙酸）；流速1 mL/min；檢測波長200 nm；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

1.3.7 數據處理

實驗數據為3組平行試驗均值，通過Origin 9.0和SPSS 23.0進行作圖以及數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 溫度和氮源對乳酸乳球菌生物量的影響

考察4%蛋白胨（單一氮源）和以1%的酵母浸粉替代1%的蛋白胨（復合氮源，1%酵母浸粉+3%的蛋白胨）對乳酸乳球菌生長代謝及菌體對基質消耗的得率系數（Yx/s）的影響，結果見表2。

表2 不同溫度和氮源對菌體生長及菌體對基質消耗的得率系數的影響Table 2 Effects of different temperature and nitrogen sources on the growth of bacteria and yield coefficient of substrate consumption

由表2可知，在28～35 ℃培養時，復合氮源生物量均比單一氮源生物量提高15%～45%左右，這可能與復合氮源的肽和氨基酸組成更能滿足細胞轉運系統[18]對肽分子質量和氨基酸組成有關。復合氮源條件下30 ℃培養的峰值生物量為3.1×109CFU/mL，較28 ℃和35 ℃提高25%～30%，與32 ℃峰值生物量接近。

由表2可知，復合氮源條件下，30 ℃的Yx/s最高，較28 ℃、32 ℃和35 ℃分別提高52%、18.5%和39%。說明30 ℃是該菌株的最適生長溫度，與SAFARI R等[25]報道一致。在各個溫度條件下，復合氮源相對于單一氮源的Yx/s均有提高，在最適生長溫度30 ℃條件下，復合氮源Yx/s較單一氮源提高78%。進一步說明了復合氮源條件下細胞利用基質的轉化效率高于單一氮源。

因此，確定發酵氮源組成為3%蛋白胨、1%酵母浸粉，培養溫度為30 ℃。

2.2 發酵培養基配方優化正交試驗

在前期單因素試驗基礎上，以蛋白胨（A）、蔗糖（B）、玉米漿（C）添加量為影響因素，以乳球菌生物量以及Nisin效價為考察指標，進行L9（33）正交設計試驗，正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

表3 發酵培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of fermentation medium formula

表4 以生物量為評價指標正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results using biomass as evaluation index

由表3可知，影響菌體生物量的3個因素主次順序為蔗糖＞玉米漿＞蛋白胨，最佳發酵培養基組合為A2B3C3，即蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%；影響Nisin效價的3個因素主次順序為蔗糖＞蛋白胨＞玉米漿，最佳發酵培養基組合為A2B3C3，即蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%。這也驗證了關于Nisin隨細胞生長而生產并依賴于較高的菌體密度，即Nisin合成與細胞生長耦聯[5-6]的論述。由表4可知，蔗糖對菌體生物量具有極顯著影響（P＜0.01），玉米漿對菌體生長具有顯著影響（P＜0.05）。

綜上，最佳發酵培養基為蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%。

2.3 搖瓶水平發酵培養基對乳酸乳球菌生長代謝的影響

以正交優化后發酵培養基配方（蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%）作為優化組，發酵培養基配方（蛋白胨3%，蔗糖2%，玉米漿1%）作為對照組，考察搖瓶水平發酵培養基優化前后培養基對乳酸乳球菌生長的影響，結果見圖1。由圖1A可知，發酵時間6～11 h為對數生長期，優化組峰值生物量（11 h）為4.9×109CFU/mL，較對照提高43%。由圖1B可知，Nisin隨著細胞的生長而持續合成，在12 h達到峰值，優化組Nisin效價峰值（1 660 IU/mL）較對照組提高20%。結果表明，優化培養基在搖瓶水平能夠較為合理的滿足乳酸乳球菌生長以及合成Nisin的需要。

圖1 搖瓶水平發酵培養基優化前后對細胞生長（A）和Nisin合成（B）的影響Fig.1 Effects of fermentation medium on cell growth (A) and Nisin production (B) in flask cultures before and after optimization

2.4 10 L發酵罐水平分批發酵培養基對乳酸乳球菌生長代謝的影響

以正交優化后發酵培養基配方（蛋白胨5%，蔗糖3%，玉米漿2%）作為優化組，發酵培養基配方（蛋白胨3%，蔗糖2%，玉米漿1%）作為對照組，考察10 L發酵罐水平分批發酵培養基優化前后對乳酸乳球菌生長代謝的影響，結果見圖2。

圖2 10 L發酵罐水平發酵培養基優化前（A）、后（B）對細胞生長和Nisin合成的影響Fig.2 Effects of fermentation medium on cell growth and Nisin production in a 10 L bioreactor before (A) and after (B)optimization

由圖2A可知，對照組生物量13 h達到峰值，為5.6×109CFU/mL，后自溶至3.5×109CFU/mL。而Nisin效價15 h達到峰值，為1 643 IU/mL，Nisin平均合成速率vˉq為109.5 IU/（mL·h）。蔗糖由19.6 g/L迅速消耗至（11 h）5.96 g/L后緩慢消耗至4.62g/L（20h），0～11h糖消耗速率為1.24g/（L·h），而11～20 h糖消耗速率0.15 g/（L·h）。同時，乳酸由1 g/L迅速合成至10.5 g/L（11 h）后緩慢合成至14 g/L（20 h），0～11 h乳酸合成速率為0.86 g/（L·h），11～20 h乳酸合成速率為0.38 g/（L·h）。顯然11 h前后糖利用、細胞生長及乳酸生成發生重大變化。由于乳酸乳球菌乳酸發酵是其能量供應的主要來源[10]，但乳酸的積累又對細胞代謝活性產生抑制[12]，因而11 h后可能存在酸脅迫和能量供應不足的矛盾。

由圖2B可知，優化組對數生長至17 h到達峰值，為7.75×109CFU/mL，較對照提高了38%，13 h細胞生物量（5.3×109CFU/mL）與對照持平，但優化組對數期較對照延長了4 h。顯然，加強碳源供給能夠有效促進菌體生長。伴隨細胞生長，Nisin合成至17 h達到峰值2 573 IU/mL，Nisin平均合成效率為151.4 IU/（mL·h），分別較對照提高56.6%和38.2%。說明氮源的增加以及其比例的改變有助于Nisin合成。另外，消后蔗糖由29.7 g/L迅速消耗至（11 h）15.6 g/L，17 h蔗糖質量濃度為11.8 g/L。0～11 h糖消耗速率為1.28 g/（L·h），與對照持平；11～17 h糖消耗速率為0.63 g/（L·h），較對照提升320%。同時，乳酸由0 h的1.5 g/L迅速合成至11 h的11.5 g/L、17 h的16 g/L。0～11 h乳酸合成速率為0.9 g/（L·h），略高于對照。11～17 h乳酸合成速率為0.75 g/（L·h），較對照提升97%。結果表明，優化培養基在11 h后能持續促進細胞生長，為Nisin高效合成提供了高細胞密度基礎[5，13]，而且在糖供應增強的情況下，細胞的耐酸性也增強了。

對照組產物對菌體的得率系數（Yp/x）為29.2IU/108CFU，而優化組Yp/x為33.2 IU/108CFU，提高了13.7%。結果表明，優化后氮源濃度以及比例（蛋白胨以及玉米漿）不僅能給細胞的生長提供豐富的氮源，還能為Nisin合成提供更豐富的肽分子前體，進而促進了單位細胞的Nisin合成效率。

2.5 分割發酵對Nisin合成的影響

分割發酵[20]方式能快速啟動細胞生長從而促進Nisin快速合成，因此考察分割發酵方式對乳球菌生長及Nisin合成能力的影響，結果見表5和圖3。

表5 分割發酵平均細胞生長速率及平均Nisin效價合成速率結果分析Table 5 Results analysis of average cell growth rate and average Nisin synthesis rate of segmentation fermentation

由表5和圖3可知，乳酸乳球菌分批發酵對數生長至17h（8.1×109CFU/mL），平均生長速率為4.76×108CFU/（mL·h）。Nisin合成與生長耦聯，18 h的Nisin效價為2 656 IU/mL，平均合成速率為147 IU（/mL·h）。

圖3 18 h、29 h、40 h和51 h分割發酵對細胞生長和Nisin合成的影響Fig.3 Effects of segmentation fermentation on cell growth and Nisin production in a 10 L bioreactor at 18 h,29 h,40 h and 51 h,respectively

18 h以30%的比例進行分割培養，分割后（19 h）生物量為1.75×109CFU/mL，Nisin效價為0 IU/mL，對數生長7 h達到6.2×109CFU/mL，Nisin效價達到峰值（26 h，2 174 IU/mL），平均生長速率為6.36×108CFU/（mL·h），較分批發酵提高40%；Nisin平均合成速率為311 IU/（mL·h），較分批發酵增長112%。

29 h以25%的比例進行分割培養，分割后（30 h）生物量為1.4×109CFU/mL，Nisin效價為0 IU/mL，對數生長7 h達到6.1×109CFU/mL，Nisin效價達到峰值（37 h，2 063 IU/mL），平均生長速率為6.71×108CFU/（mL·h），較分批發酵提高41%；Nisin平均合成速率為294 IU/（mL·h），較分批發酵增長100%。

40 h以20%的比例進行分割培養，分割后（41 h）生物量為1.2×109CFU/mL，Nisin效價為0 IU/mL，對數生長7 h達到6.65×109CFU/mL，Nisin效價經10 h生長達到峰值（51 h，1 956 IU/mL），平均生長速率為7.8×108CFU/（mL·h），較分批發酵提高64%；Nisin平均合成速率為196IU/（mL·h），較分批發酵增長33%。

51 h以15%的比例進行分割培養，分割后（52 h）生物量為6×108CFU/mL，Nisin效價為0 IU/mL，對數生長7 h達到6.5×109CFU/mL，Nisin效價經10 h生長達到峰值（62 h，1 850 IU/mL），平均生長速率為8.4×108CFU/（mL·h），較分批發酵提高76%；Nisin平均合成速率為185IU/（mL·h），較分批發酵增長26%。

15%、20%、25%和30%分割比例平均生長速率較分批培養分別提高了76%、64%、41%和40%；而30%、25%、20%和15%分割比例的Nisin平均合成速率較分批培養分別提高了112%、100%、33%和26%。顯然分割比例越大，Nisin平均合成速率越高。考慮到分割發酵比例越高，用于Nisin產品生產的發酵液體積就越少，而且30%分割比例較25%分割比例僅僅提高5.8%，因此確定25%為最適分割比例。

3 結論

本研究通過正交試驗確定乳酸乳球菌的最佳培養基配方為5%蛋白胨，3%蔗糖，2%玉米漿，1%酵母浸粉，0.2%磷酸氫二鉀，0.2%氯化鈉，0.02%七水硫酸鎂，0.005%一水硫酸錳，0.5%檸檬酸三銨，0.6%輕質碳酸鈣，pH 6.8；培養溫度為30 ℃。搖瓶發酵11 h生物量為4.9×109CFU/mL，較對照提高43%，Nisin效價為1 660 IU/mL，較對照提高20%。10 L罐分批發酵中生物量在17 h達到7.75×109CFU/mL，較對照提高38%，Nisin效價為2 573 IU/mL，較對照提高56.6%。分批發酵對數生長18 h（Nisin平均合成速率vˉq為147 IU/（mL·h），以不同比例分割發酵并繼續培養7 h，第二次分割發酵（25%）的Nisin平均合成速率達到294 IU/（mL·h），較分批發酵提高了100%。該研究結果為Nisin工業發酵提供一定的理論以及數據支撐。