藥桑葡萄果酒對高脂血癥大鼠的降血脂作用

古麗米熱·祖努納，王偉雄，黎進雪，呂 澤，雷 靜，麥爾丹·安尼瓦爾，蒙富聲，武 運*

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院 吐魯番農業科學研究所，新疆 吐魯番 838000）

隨著人均收入的逐漸提高，飲食結構和習慣的多元化，高血脂癥的發病率在全世界都普遍呈上升趨勢[1]，進而導致多種心血管疾病和并發癥的高發[2]。高脂血癥正在迅速成為一種常見的多種臨床癥狀[3-4]，可誘發多種疾病，如心肌梗死和動脈粥樣硬化以及高血壓等[4]。長期食用高脂肪食品會增加肝臟和血液中總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和游離脂肪酸的水平，影響肝臟代謝，降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等肝酶的抗氧化活性，從而加速活性氧物種的生成[5]。

目前，西藥在控制高脂血癥方面表現出一定的優勢，毒副作用會隨著時間而逐漸顯現[6]。研究表明，中草藥能有效控制高血脂患者血脂水平、預防心血管疾病和改善患者的身體機能，可長期服用[7]。功能性食品具有營養保健的功能，即可藥用又可食用，且長期食用也無毒副作用，在治療和預防動脈粥樣硬化性高血脂癥方面有優勢[8]。新疆藥桑是珍貴的藥物和營養制品，是新疆地區獨一無二的特殊稀貴資源[9]，藥桑生長過程中積累了豐富的花青素和黃酮類成分，具有很高的營養和藥用價值，如降血糖和降血脂、抗癌、抗氧化、抗炎等[10]。目前藥桑的研究主要集中于對其活性物質的提取、分離和鑒定，對其藥理研究較少，致使藥桑沒有得到充分的利用[9-10]。YANG X等[11]研究發現，在高脂肪飼料中添加5%和10%桑葚凍干粉，飼喂小鼠4周之后，小鼠的血清、肝臟TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、致動脈粥樣硬化指數均降低。LIM H H等[12]用桑葉提取物（mulberry leaf extract，MLE）和桑果提取物（mulberry fruit extract，MFE）可有效改善肥胖和肥胖相關的炎癥和氧化應激。與水果相比，果酒富含酚類化合物，能夠在體內顯示抗氧化特性[13]，果酒中的維生素更容易被人體所吸收，長期適量飲用，能降低動脈硬化、高血壓、心腦血管等疾病的風險[14]。根據每種水果含有的不同營養成分及保健價值，可以通過將一定比例的不同水果進行復合發酵從而得到營養全面且具有更好保健價值的復合果酒[15]。

到目前為止，大多數現有的研究都基于單一類型的桑葉或桑果實驗，而藥桑和葡萄復合酒的有益作用應用在高血脂方面的研究較少。本試驗用藥食同源植物藥桑和赤霞珠葡萄發酵的復合酒對Wistar大鼠進行灌胃，研究藥桑葡萄果酒對高脂血癥水平的降脂功效。旨在為豐富新疆葡萄酒品類的多樣化，增補葡萄酒市場上藥食同源植物復合的空白，提高藥桑葚和葡萄的附加值，開發降血脂功效的產品，為藥食同源植物的開發利用提供創新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗動物：清潔級雄性Wistar大鼠48只，體質量約（174.73±8.20）g左右，購自新疆醫科大學動物研究中心，合格證號SCXK（新）2018-0002。飼養條件：溫度為（25±1）℃，相對濕度60%，晝夜比例為12 h∶12 h，飲水不控制。按組分籠喂養，用普通飼料和高脂飼料及高脂乳劑（自制）飼喂。

動物飼料：高脂飼料配方為基礎飼料78.8%、豬油10.0%、蛋黃粉10.0%、膽固醇1.0%、膽鹽0.2%。高脂乳劑的制備方式為豬油融化，加入膽固醇和丙硫氧嘧啶攪拌，添加吐溫-80和丙二醇，再緩慢加入膽酸鈉溶液，研磨，加水混勻，即得[16]。

灌胃用酒：藥桑葡萄果酒為新疆農業大學食品科學與藥學學院食品生物發酵與質量安全研究室提供。藥桑與葡萄原料質量比3∶1，酒精度12%vol，總酚含量2 872.48 mg/L，花青素含量1 568 mg/L。

1.1.2 試劑

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；4%多聚甲醛組織固定液：成都金山化學試劑有限公司；氯化鈉注射液：廣州市珈源醫學試劑有限公司；血脂康膠囊：北京北大維信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LE2002E/02電子天平：河南恒資電子科技有限公司；D1-16X臺式高速離心機：陜西德祥設備有限公司；S/N601-1037酶標儀：德國BMG公司；JB-P5包埋機：武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機：上海徠卡儀器有限公司；XSP-C204顯微鏡：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與處理

48只清潔級Wistar雄性大鼠，稱質量后分籠喂養，每籠8只，標號，在實驗環境中適應7 d，根據體質量測定結果將大鼠隨機分為（1）正常對照組A（8只）、（2）高脂模型飼料組B（40只），組間大鼠體質量無顯著差異（P＞0.05）。正常對照組飼喂基礎飼料，自由采食，以生理鹽水灌胃處理，模型組飼喂高脂飼料和灌胃高脂乳劑處理，高脂乳劑量為0.01 mL/g，飲水不控制。4周后，斷尾取血，分離血清，檢測血脂水平，確認是否建立高脂血癥模型。

1.3.2 實驗動物分組及灌胃

根據TC、TG水平和體質量大小，再將模型組隨機分為5組，正常對照組、空白模型組、陽性組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。每組8只，組間大鼠體質量差異無顯著性（P＞0.05）。正常對照組灌胃生理鹽水，飼喂普通飼料；空白模型組灌胃生理鹽水，飼喂高脂飼料灌胃高脂乳劑；陽性藥對照組灌胃血脂康混懸液，飼喂高脂飼料。藥桑葡萄果酒樣品灌胃劑量按照《實驗生理科學》中的相關公式[17]，依據《2016 年中國居民膳食指南》中推薦的每人每天葡萄酒飲酒量（150 mL，即2.5 mL/kg）換算得到[22]，按照人體推薦量的1倍、5倍（大鼠與人的等效劑量）、10倍為酒的低劑量2.5 mL/kg、中劑量12.5 mL/kg、高劑量25 mL/kg（以每只Wistar大鼠的平均體質量200 g計[18]）計算，灌胃劑量隨大鼠狀態及體質量變化而調整。每日灌胃1次，連續30 d。將血脂康膠囊內容物研碎，制成混懸液，根據等效劑量換算，大鼠的血脂康膠囊給藥劑量應為24 mL/kg[19]。每天仔細觀察大鼠死亡、飲食水、糞便、精神和毛發情況，每周稱質量1次，并記錄體質量。

表1 不同實驗組大鼠給藥方案Table 1 Administration regiments of rats in different experimental groups

續表

1.3.3 血清生化指標測定

在灌胃結束后，所有大鼠禁食12 h但不禁水，次日上午稱質量后，頸動脈取血。血樣4 ℃靜置2 h后，3 200 r/min離心13 min，取無溶血血清通過相應試劑盒測定大鼠血清樣本中TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、CAT、MDA的含量。解剖大鼠，迅速摘取大鼠整個肝臟、心臟和剖離體內脂肪組織，計算肝臟指數和脂肪指數。制作組織切片，進行病理組織學觀察。

1.3.4 數據處理

結果為平均值±標準偏差（standard deviation，SD）。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，采用單因素方差分析。分別使用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進行數據統計。

2 結果與分析

2.1 大鼠高脂模型建立

造模前、后大鼠血清的TC、TG含量以及體質量測定結果見表2。由表2可知，隨著飼喂高脂飼料時間的推移，造模組大鼠反應較正常組有些遲鈍，體質量增長，精神逐漸萎靡。經高脂飼料飼喂4周后，與正常對照組比較，空白模型組動物血清TC、TG升高（P＜0.05），空白模型組大鼠的TC、TG含量分別高出正常對照組1.67倍和2.85倍，體質量提高14%，具有顯著差異（P＜0.05），結果表明，高脂血癥大鼠模型已經成功建立。

表2 造模前、后大鼠血清總膽固醇、甘油三酯含量和體質量對比Table 2 Comparison of serum total cholesterol,triglyceride levels and body mass in rats before and after modeling

2.2 大鼠體質量測定結果

在飼養期間，記錄各組大鼠體質量變化，其結果如表3所示。在造模和給藥期間，正常組大鼠狀態活潑，無死亡情況，飲食正常，體質量持續增加。模型組大鼠無死亡情況，但體質量增加較快。其他給藥組無死亡情況，飲食正常，大小便無異常。給藥前，與正常對照組相比，各試驗組大鼠體質量無顯著差異（P＞0.05）。給藥后各試驗組大鼠體質量均呈現不同程度增長的趨勢，統計學具有顯著差異（P＜0.05），高脂模型建立成功后（第4～8周），與正常組相比，空白模型組大鼠體質量增長率較高，除模型組和低劑量組外其他各組之間體質量均無顯著性差異（P＞0.05）。模型組大鼠終體質量達到416.5 g，與正常組相比，模型組大鼠體質量增加38%。與模型組相比，高劑量組、中劑量組和低劑量組體質量增加值分別降低45.72%、42.00%和31.54%。說明長期飼喂高脂飼料會造成大鼠體質量明顯的增長，藥桑葡萄酒組對控制大鼠體質量的增長起到一定的作用。與ZOUZ Y等[20-21]的研究結果一致。

表3 藥桑葡萄果酒對大鼠體質量的影響Table 3 Effect of medicine-mulberry and grape wine on the body mass of rats

新陳代謝直接影響脂肪堆積。研究表明，飲食中豐富的維生素和礦物質是促進新陳代謝的物質基礎[3]。新疆藥桑礦物質元素和維生素含量豐富，利用藥桑復合發酵制備出的藥桑葡萄果酒仍能保留較高的營養成分。這些功能成分有利于促進新陳代謝和降血脂作用[23-24]。由表3可知，從灌胃第2周開始，大鼠體質量增長速度減慢。經過4周灌胃，模型組大鼠較正常組體質量增加顯著（P＜0.05）。空白對照組、藥桑葡萄果酒高、中、低劑量組、陽性對照組的體質量增加值顯著小于空白模型組體質量增加值（P＜0.05），說明藥桑葡萄果酒灌胃能有效抑制高脂飲食引起的大鼠體質量增加，能使大鼠的體質量處于正常范圍內增長。

2.3 大鼠血清指標測定結果

血液中TG、TC、LDL-C和HDL-C是判斷機體血脂情況的常用指標，代謝類疾病和心腦血管疾病的發生常常伴隨著血清TG、TC及LDL-C水平的升高或HDL-C含量的降低[22]。藥桑葡萄果酒對大鼠血脂的影響結果見表4。

由表4可知，在灌胃結束后（第8周），與正常組相比，空白模型組大鼠血清TC、TG及LDL-C含量升高（P＜0.05），分別達到4.38 mmol/L、1.12 mmol/L、1.38 mmol/L，HDL-C顯著低于正常組（P＜0.05），降低至0.85 mmol/L，說明高脂飲食導致血脂紊亂。

表4 藥桑葡萄果酒對大鼠血脂的影響Table 4 Effect of medicine-mulberry and grape wine on blood lipids of rats mmol/L

本研究表明，藥桑葡萄果酒能顯著降低高脂血癥大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，能夠顯著升高血清中HDL-C含量（P＜0.05）。與空白模型組相比，藥桑葡萄果酒高、中、低劑量組的TC含量分別下降27.87%、36.96%和22.80%，TG分別下降49.38%、62.63%和43.51%。與空白模型組相比，低、中、高劑量藥桑葡萄果酒處理能顯著增加大鼠HDL-C的含量（P＜0.05），GEPNER Y等[25]研究發現，適量的飲酒會降低心血管和高血壓等疾病的患病幾率，并在改善血脂方面有一定的優勢。MACEDOL等[26]研究發現，攝入適量的紅酒可以減少氧化應激和炎癥，從而改善脂質代謝和預防冠心病等疾病。YANG H等[3]研究表明，與模型組相比，海紅果酒中劑量組水平降低高脂血癥大鼠血清TG、TC、LDL含量，增加HDL含量最為顯著。這也與彭淼等[22，27]的研究結果一致。HDL-C含量的增加有利于血液循環將多余的膽固醇（TC）從外周組織或細胞運輸到肝臟進行分解代謝，減輕體質量，并改善高脂血癥大鼠的脂質代謝異常[28]。說明藥桑葡萄果酒可通過升高HDL-C的含量，改善脂質代謝異常。與彭淼[23]在刺葡萄酒中的研究結果一致。此外，藥桑葡萄果酒中劑量組中TC含量顯著降低至（2.76±0.03）mmol/L（P＜0.05）；各藥桑葡萄果酒高、中、低劑量處理組中TG含量均顯著降低（P＜0.05），分別為（0.57±0.04）mmol/L、（0.42±0.01）mmol/L、（0.64±0.04）mmol/L；藥桑葡萄果酒中劑量組和高劑量組中HDL-C含量顯著增加至（1.14±0.14）mmol/L和（1.11±0.14）mmol/L（P＜0.05）；藥桑葡萄果酒中劑量組、高劑量組中LDL-C含量均顯著降低（P＜0.05），為（0.44±0.02）mmol/L和（0.50±0.03）mmol/L。本研究中，藥桑葡萄果酒降低了血液中TG、TC和LDL-C的含量，這表明藥桑葡萄果酒可清除沉積在動脈壁上的TC等脂質，還可能通過上調HDL-C水平來增強機體抗氧化能力，從而減輕高脂血癥的發病幾率。綜合來說，藥桑葡萄果酒各劑量組均有一定的降血脂功效，對機體健康具有積極作用，并具有統計學意義。

2.4 藥桑葡萄果酒對高脂血癥模型大鼠血清CAT、SOD和MDA的影響

高脂血癥通常會降低抗氧化水平并增加活性氧的產生，過度產生的活性氧會攻擊與脂質代謝相關的細胞組織，導致脂質代謝紊亂[29]。CAT與SOD酶協同發生作用進而清除高脂血癥大鼠體內氧自由基。CAT和SOD酶活性高低、含量多少也是體內抗氧化能力的一個重要指標。藥桑葡萄果酒對各組大鼠血清中CAT含量、SOD活性和MDA含量的影響見圖1。

圖1 藥桑葡萄果酒對各組大鼠血清中過氧化氫酶（a）、超氧化物歧化酶（b）活性和丙二醛（c）含量的影響Fig.1 Effect of medicine-mulberry and grape wine on catalase (a),superoxide dismutase (b) activities and malonadlehyde (c)contents in serum of rats

由圖1可知，與正常對照組相比，空白模型組中SOD和CAT活性顯著降低至179.66 U/mL和108.43 U/mL（P＜0.05），MDA含量顯著升高至4.05 nmol/mL（P＜0.05）。高脂飲食顯著降低了大鼠肝臟的SOD和CAT活性（P＜0.05），引起大鼠脂質代謝紊亂。

與空白模型組相比，各不同劑量組藥桑葡萄果酒均能顯著提高CAT和SOD活性（P＜0.05）。藥桑葡萄果酒高、中、低劑量組大鼠血清SOD活性分別比空白模型組上升了26.03%、32.48%和22.20%，表明藥桑葡萄果酒能顯著增強SOD活性（P＜0.05），從而增強機體清除自由基能力。藥桑葡萄果酒高、中、低劑量組大鼠血清CAT活性分別比模型組升高47.09%和49.94%和40.62%，表明藥桑葡萄果酒能顯著增強CAT活性（P＜0.05）。表明藥桑葡萄果酒可降低氧化應激，從而降低血清脂質過氧化。藥桑葡萄果酒低、中、高劑量組能顯著降低MDA水平（P＜0.05），分別為2.89 nmol/mL、2.26 nmol/mL、2.67 nmol/mL（P＜0.05）。王秀萍等[30]研究表明，苦蕎發酵酒高、中劑量組與模型對照組相比，小鼠腦、肝組織中的SOD活性有一定的升高，尤其以中劑量組表現顯著。彭淼等[22]研究結果表明，刺葡萄酒低、中劑量組能顯著增強SOD活性。藥桑葡萄果酒含有多酚、黃酮、多糖、花青素、維生素和礦物質等營養和活性物質。這些活性成分含有強還原性酚羥基，并對金屬離子具有很強的螯合能力。它們可以減少或防止自由基的過度產生，并保護內壁血管免受損傷。同時能維持瘦素的正常功能，提高機體免疫力，抵抗疾病的發生[32]。由此可知，藥桑葡萄果酒可以提高抗氧化酶活性，降低脂質過氧化。

2.5 肝臟及脂肪指數測定結果

臟器指數能反映試驗動物內臟的病變狀況見表5。由表5可知，與正常組相比，模型組大鼠肝臟指數、脂肪指數顯著升高（P＜0.05）。說明高脂飲食導致肝組織脂肪的堆積，肝臟的脂肪變性。藥桑葡萄果酒高、中、低劑量組肝臟指數與空白模型組相比，分別降低15.41%、17.57%和8.38%，脂肪指數分別降低33.33%、36.36%和29.70%。由此說明，一定劑量的藥桑葡萄果酒可以抑制大鼠肝臟和脂肪指數的增加，改善機體機制代謝異常。

表5 藥桑葡萄果酒對高血脂癥模型大鼠肝臟指數及脂肪指數的影響Table 5 Effect of medicine-mulberry and grape wine on liver indexes and fat indexes of hyperlipidemia model rats

2.6 大鼠肝臟病理學觀察

大鼠肝臟的病例組織學觀察結果見圖2。由圖2可知，正常組大鼠肝臟組織結構良好且清晰，著色良好，肝細胞排列整齊，未見脂肪變性，表明正常飲食對大鼠脂質代謝無不良影響。空白模型組肝細胞排列不規則也有輕微腫大的表征，說明肝臟細胞受損，間胞質染色變淺，細胞間隙和細胞內可見許多大小不一的白色脂肪滴空泡，并呈彌漫性脂肪變性而導致輕微的脂肪肝。給藥后肝組織結構較空白模型組變清晰，藥桑葡萄果酒低劑量肝細胞排列較正常組紊亂，藥桑葡萄果酒中、高劑量組肝細胞排列較整齊，接近于正常對照組，基本上沒有脂肪滴空泡，肝細胞基本恢復正常，中劑量組肝細胞恢復更明顯。說明藥桑葡萄果酒能顯著提升肝臟健康水平，維持肝臟的正常脂質代謝。

圖2 6組大鼠肝臟病理組織學觀察結果（400×）Fig.2 Observed results of histopathology of liver tissues from rats in six groups (400×)

2.7 大鼠心臟病理學觀察

大鼠的心臟病理組織學觀察結果見圖3。由圖3可知，正常組大鼠心臟內的心肌細胞排列緊密整齊，細胞為短柱狀，胞質呈粉色，心肌細胞無變性、水平條紋清晰。模型組部分心肌細胞輕度肥大，染色淺，胞質局部淡染，心肌纖維排列紊亂，少量可見脂肪組織浸潤而形成的空泡，間質內可見炎細胞浸潤。藥桑葡萄果酒高、中劑量組心肌細胞排列整齊，結構接近正常組，細胞形態趨于短柱狀，細胞外基質減少，心肌病理性改變有所改善。說明藥桑葡萄果酒對高脂血癥大鼠的心肌有保護作用。流行病學研究表明，抗氧化劑減慢了心肌梗死的發生和發展[33]。適量的飲用藥桑葡萄果酒對心血管疾病發病率產生一定的影響，這對改善動脈粥樣硬化和其他心血管疾病的預防方面有一定的優勢。

圖3 6組大鼠心臟病理組織學觀察結果（400×）Fig.3 Observed results of histopathology of heart disease from rats in six groups (400×)

3 結論

本研究表明，藥桑葡萄果酒可以很好的改善高脂血癥大鼠血脂水平。與空白模型組相比，藥桑葡萄果酒組可以顯著升高HDL-C含量，顯著降低TC、TG、LDL-C含量，可以顯著升高SOD、CAT酶活性，降低MDA含量（P＜0.05），說明藥桑葡萄果酒具有很好的抗氧化效果，可以通過提高抗氧化酶活力，很好的抑制體內脂質過氧化，從而改善高脂血癥大鼠血脂水平。藥桑葡萄果酒中劑量組可以將高脂血癥大鼠血清HDL-C、TG恢復到接近于正常水平，能夠明顯降低臟器指數和脂肪指數，抑制肝臟組織的脂肪性病變。通過制作大鼠肝臟和心臟病理切片，觀察到高脂血癥大鼠肝臟和心臟病變程度，結合各組大鼠血脂指標、抗氧化酶指標及肝臟切片來看，適量灌胃藥桑葡萄果酒可顯著提升肝臟健康水平。說明了藥桑葡萄果酒能有效改善肝臟組織，抑制肝臟中脂質的積累，降低病變程度。綜合上述得出，適量的藥桑葡萄果酒能夠有效的調節Wistar大鼠高血脂水平，本研究結果為預防心血管疾病和降血脂方面提供了一定的理論依據。