高鹽稀態牡蠣釀造醬油的開發與品質分析

錢冠蘭，孫建安，毛相朝

（1.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266000；2.青島燈塔味業有限公司，山東 青島 266300）

隨著人們生活水平的不斷提升，對飲食的品質需求也越來越高，以醬油為代表的調味品對于增加食品的鮮美風味具有重要作用。近年來，人們對于醬油的風味和品類的需求也呈現越來越高的趨勢，具有特殊風味的同時兼具一定功能的醬油成為醬油產業發展的一個重要方向[1]。

牡蠣，屬于牡蠣科的一種軟體動物，作為一種味道鮮美、營養豐富的功能保健海洋性食品，牡蠣含有豐富的牡蠣多肽、多糖、多不飽和脂肪酸、牛磺酸、維生素、礦物質等活性成分，是一種食用口感和營養價值俱佳的食物[2-4]。其獨特的價值及產品開發也成為國內外的研究熱點，牡蠣的水解加工是提升牡蠣產品價值和功能活性的重要加工方式[5-8]。MIAO J等[9]研究結果表明，牡蠣經過蛋白酶水解處理后，水解液中富含抗疲勞、抗氧化活性成分。UMAYAPARVATHI S等[10]從牡蠣水解物中分離出具有對人結腸的抗癌功效的抗氧化多肽，這為牡蠣水解物用于食品和營養保健品中提供了指導。將牡蠣應用于醬油釀造中，既可以充分發揮牡蠣原料的保健功能活性，又能豐富醬油的海鮮風味，具有較高的應用價值和研究意義。

目前國內的調味品市場上，海鮮醬油品種較少，國外則少有海鮮醬油的研究報道，海鮮調味品種類主要集中于魚露、蝦醬、蝦油等[11-14]。已報道文獻中使用牡蠣為原料的調味品主要是使用傳統工藝生產的蠔油產品[15]，但蠔油產品的使用場景和風味與醬油又有著明顯的不同，難以適用于使用醬油的烹飪場景。使用牡蠣為原料制作醬油的報道較少，孔繁東等[16]使用牡蠣、豆粕和麩皮為原料，通過試驗優化制曲配料比和發酵條件，采用低鹽固態發酵釀造出了海鮮風味濃郁，氨基酸態氮、牛磺酸含量豐富的牡蠣醬油，但該工藝為開放式高溫發酵，對醬油風味和口感均有一定的影響。因此，為了提升牡蠣醬油的生產效率和風味品質，本研究首先對牡蠣進行蛋白酶酶解處理，后將其酶解液隨豆粕、小麥等一起經過高鹽稀態發酵，在較短的發酵時間內釀制出一種具有良好風味和豐富營養成分的牡蠣醬油。牡蠣醬油的開發對于牡蠣資源的開發利用與新型海鮮風味醬油的研制都具有重要意義，更為海洋生物資源在食品產業的開發和高值化利用提供有利的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：石家莊鼎新科技有限公司；復合酵母（魯氏酵母（Sacharomyces rouxi）、球擬酵母（Torulopsis bombicola）約1∶1混合）：青島燈塔味業有限公司。

太平洋牡蠣：青島海泉嶗山特色水產品公司；豆粕（一級，蛋白≥46%）：九三食品股份有限公司；小麥（四級，容重≥730）：青島品品好食品發展有限公司；食鹽：市售。

中性蛋白酶（酶活150 000 U/g）：龐博生物工程有限公司；牛磺酸等氨基酸標準品（純度＞99.0%）：美國Sigma 公司；其他試劑均為國產分析純。

種曲培養基：豆粕75 g，小麥粉25 g，水60 mL。121 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

L18-Y915S破壁機：九陽股份有限公司；DK-S26水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；SPX-280恒溫培養箱：寧波江南儀器廠；VC4-H2生物冰箱：海爾電器有限公司；5804R離心機：德國Eppendorf公司；pHS-3E型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Kjeltec 2300凱氏定氮儀：福斯分析儀器有限公司；Waters Alliance 2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國沃特世科技有限公司；7980-5975c氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種曲的制備

種曲的制備：種曲培養基滅菌冷卻至室溫后，按0.3%的接種量接入米曲霉，30 ℃條件下，制曲約42～48 h出曲（約22～24 h翻曲一次，曲料表面出現裂痕，便開始翻曲）。參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》測定成曲的中性蛋白酶酶活[17]。所制得的種曲呈黃綠色，表面有孢子，中性蛋白酶活力為1 700 U/g。

1.3.2 牡蠣酶解液的制備

牡蠣按料液比1∶5（g∶mL）加水勻漿后，按1%添加量（以牡蠣濕質量計）加入蛋白酶，40 ℃下酶解8 h，可獲得水解度為31.2%的牡蠣酶解液[16]。

1.3.3 牡蠣醬油的加工工藝流程及操作要點

操作要點：種曲制作完成后，加入低于4 ℃的飽和鹽水（23%），進行低溫發酵（發酵溫度＜10 ℃）15 d。然后在第15～30天，緩慢進行升溫，每天升溫1 ℃。在第30～120天，發酵過程控溫在25～28 ℃。期間在發酵第40～50天，按添加量2.5%加入復合酵母，在加入酵母發酵10 d左右后，便加入牡蠣酶解液（0%（對照）、15%、20%、25%、30%）進行共同發酵，直到發酵期滿120 d。對照醬油的釀造除牡蠣酶解液用等量的飽和鹽水代替外，其他工藝流程均與牡蠣醬油一致。

1.3.4 感官評價

使用定量描述分析對醬油的色澤、亮度、掛壁性、香氣、咸度、甜度、鮮度、海鮮風味及整體評價9個方面進行評價。感官評價實驗在室溫（23±2）℃條件下進行，由12位經培訓過的感官評定員（6男6女）對醬油樣品進行0～10分的評分。0分代表特性最低值，10分代表特性最高值，具體評分標準見表1。

表1 牡蠣醬油的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of oyster soy sauce

1.3.5 理化指標分析檢測

NaCl含量的測定：參照國標GB 5009.42—2016《食鹽指標的測定》；總酸（total acid，TA）含量的測定：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；氨基酸態氮（amino nitrogen，AN）含量、全氮（total nitrogen，TN）含量的測定：參照國標GB/T 18186—2000《釀造醬油》。水解度計算公式如下：

1.3.6 氨基酸含量測定

稱取一定量的醬油樣品于水解管中，加入15mL6mol/L HCl，樣品溶解后，在110 ℃的恒溫干燥箱中水解20～24 h，定容成水解液。取20 mL上述水解液進行真空干燥，樣品衍生，再次進行干燥。將樣品稀釋液與干燥樣品混合溶解，以8 000 r/min轉速、4 ℃離心15 min，取上清液采用高效液相色譜法測定。

牛磺酸含量的測定：參照國標GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的測定》中的第一法。

1.3.7 揮發性風味物質成分含量的測定

醬油中揮發性風味物質成分測定采用氣相色譜-質譜聯用法。

前處理條件：稱取樣品10 mL，加入到20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋以防風味成分揮發。于60 ℃磁力攪拌5 min后，用固相微萃取針萃取30 min，立即插入氣相色譜-質譜儀器的進樣口，于進樣口250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度設置為250 ℃，升溫程序為：初始溫度為50 ℃，保持5 min，先按4 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再按10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。選用不分流模式進樣，載氣為氦氣（He），流速為1.0 mL/min。

質譜條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量掃描范圍為40～400 amu。

定性定量分析：質譜數據庫為美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）08，選擇匹配度＞80%的峰對醬油的揮發性風味物質進行定性分析。采用面積歸一化法定量各揮發性成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 牡蠣酶解液在醬油中添加量優化

氨基態氮含量是醬油品質的一項關鍵性評價指標，由圖1可知，牡蠣酶解液添加量為25%的牡蠣醬油氨基態氮含量最高，達1.2 g/100 mL。牡蠣醬油全氮含量為1.9 g/100 mL，比對照組提高了0.07 g/100 mL，比國標GB 18186—2000《釀造醬油》中特級醬油（1.5 g/100 mL）提高了0.4 g/100 mL。牡蠣酶解液添加量為25%的牡蠣醬油pH為5.6，NaCl含量達16.1 g/100 mL，總酸含量為1.45 g/100 mL，均符合國標GB 18186—2000《釀造醬油》特級醬油標準。故綜合考慮原料成本、工藝操作性及產品品質等因素，確定最佳牡蠣酶解液添加量為25%。

圖1 牡蠣酶解液添加量對醬油的全氮及氨基態氮含量的影響Fig.1 Effect of oyster hydrolysate addition on total nitrogen and amino nitrogen content in soy sauce

2.2 牡蠣醬油的感官評價

由圖2可知，牡蠣醬油及對照醬油感官整體評分分別為8.8分、6.8分。在海鮮風味方面，牡蠣醬油得分8.5分，對照醬油得分5.0分，表明牡蠣醬油的海鮮風味相較對照醬油極為突出。此外，在鮮度及香氣方面，牡蠣醬油得分為6.7分、7.8分，對照醬油得分為5.7分、4.7分，牡蠣醬油均表現出一定的優勢。表明該牡蠣醬油具有香氣濃郁、海鮮風味顯著的特點。

圖2 牡蠣醬油與對照醬油感官分析雷達圖Fig.2 Radar chart of sensory evaluation of oyster soy sauce and control soy sauce

2.3 牡蠣醬油的氨基酸含量分析

由表2可知，牡蠣醬油和對照醬油中均鑒定出17種氨基酸，其中必需氨基酸（essential amino acid，EAA）有7種，牡蠣醬油和對照醬油中的必需氨基酸分別占總氨基酸（total amino acid，TAA）的42.8%、41.9%，而必需氨基酸/非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）分別為74.9%、72.2%，接近世界衛生組織（world health organization，WHO）/聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization，FAO）的推薦氨基酸模式（EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%以上），氨基酸比例合理，是一種質量較佳的蛋白調味品。牡蠣醬油和對照醬油均富含6種鮮味氨基酸，其鮮味氨基酸含量分別占氨基酸總量的41.8%、40.5%。從幾種鮮味氨基酸含量可看出，牡蠣醬油的各類鮮味氨基酸含量均略高于對照醬油，此結果與感官評價實驗結果一致，可見該牡蠣醬油具有更為鮮美的風味。

表2 牡蠣醬油與對照醬油的氨基酸種類及含量測定結果Table 2 Determination results of amino acids kinds and contents in oyster soy sauce and control soy sauce

此外，在非蛋白質氨基酸的分析中可以看出，相較沒有添加牡蠣酶解液的對照醬油，牡蠣醬油中牛磺酸的含量顯著提高，其牛磺酸的含量高達36.7 mg/100 g，約為對照醬油中牛磺酸的含量（2.7 mg/100 g）的13.6倍。研究表明，牛磺酸對人體具有抗氧化、解毒、神經調節及穩定細胞膜等功能活性[18-20]，高含量的牛磺酸有可能為牡蠣醬油增加一定的功能活性。

2.4 牡蠣醬油的揮發性風味成分

通過GC-MS分別檢測了牡蠣醬油和對照醬油中的揮發性風味物質，主要的揮發性成分及其相對含量（相對含量＞0.4%）、揮發性風味成分類別分別見表3和表4。

表3 牡蠣醬油與對照醬油中主要揮發性風味成分含量的測定結果Table 3 Determination results of major volatile flavor components contents in oyster soy sauce and control soy sauce

表4 牡蠣醬油與對照醬油揮發性風味成分類別Table 4 Types of volatile flavor components in oyster soy sauce and control soy sauce

由表3和表4可知，牡蠣醬油和對照醬油在揮發性成分上大部分是相同的，但也各具獨特性，尤其是在各類揮發性成分的相對含量上存在較大的差異。從揮發性物質的相對含量而言，兩種醬油均以醇類物質居多，其他類物質的相對含量則存在較大的差異。醇類物質是在醬油釀造過程中經酵母發酵和氨基酸降解而形成的一種常見的香味成分。典型的乙醇具有令人愉悅的酒香味，而苯乙醇則具有一種花草及水果的香味[21]。郭夢瑤等[22]通過采用液液萃取與全二維氣相色譜-嗅聞-質譜聯用對5種市售高鹽稀態醬油的揮發性成分化合物進行了探究，發現苯乙醇是醬油中的關鍵氣味化合物之一。呋喃類物質在牡蠣醬油中占據第二，明顯高于在對照醬油中的含量，這可能與牡蠣醬油的海鮮風味有較大的關聯。呋喃類物質是海鮮的一種重要風味物質，尤其是在儲存和熱加工過程中容易形成[23-24]。NGUYENT H D等[25]的研究也表明，2-甲基呋喃是形成蠔油風味的最顯著的揮發性化合物之一。此外，烯烴、醇類、醛類物質也是牡蠣風味形成的重要物質[26-27]。劉文等[28]對牡蠣體液種風味物質進行了GC-MS分析，發現新鮮牡蠣體液以清新的果香為主，略有肉香，主要揮發性成分是醛類和酯類。而經熱處理后的牡蠣肉香和焦香味增強，主要揮發性成分是酮類和呋喃類。從具體的揮發性物質含量來看，牡蠣醬油中的揮發性風味物質主要以乙醇（47.1%）、2-庚基呋喃（12.4%）、戊基呋喃酮（8.3%）、苯乙醇（6.6%）為主，而對照醬油中主要以乙醇（24.1%）、4-乙基-2-甲氧基-苯酚（又名4-乙基愈創木酚）（15.2%）、苯乙醇（7.3%）、3-甲基-丁醇（5.3%）等為主。楊曉璇等[29]對不同品牌醬油分析研究也表明，醛酮類、醇類、雜環類等是多種醬油中均能鑒定出的揮發性化合物。除此之外，4-乙基愈創木酚、呋喃酮等物質也被認為是醬油的關鍵風味物質。因此這些具有不同風味的物質在醬油中的較大差異，是使得牡蠣醬油具有獨特風味的關鍵。

3 結論

本研究采用高鹽稀態工藝，通過添加牡蠣酶解液，成功釀造出一種新型牡蠣醬油，其pH、NaCl、氨基酸態氮、全氮、總酸含量等均符合食品安全國家標準GB 18186—2000《釀造醬油》要求。此外，牡蠣醬油富含牛磺酸，約為對照醬油的13.6倍，醇類、呋喃類等揮發性風味成分含量較高，具有濃郁的海鮮風味和良好的口感的同時，營養保健價值也十分突出，這為牡蠣醬油市場的開發提供了有利的支撐。