一種簡單長期保藏乳酸菌菌種方法的研究

李莉峰，劉曉輝

（1.遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122099）

乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌[1]，在工業、農業、醫學、科研方面有著廣泛應用。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是一類兼性厭氧菌[2-3]、不運動、無芽孢的桿菌或長桿菌，單個或成對出現，屬革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性；菌落呈乳白色，為圓形，直徑大多1.0 mm以上，表面光滑、隆起，邊緣整齊。副干酪乳桿菌是近年來國外研究較多的一種益生乳酸細菌，發酵葡萄糖主要產生L-乳酸[2-3]，廣泛用于傳統發酵乳、發酵蔬菜、發酵豆制品、發酵魚制品等。副干酪乳桿菌在體外和體內都具有較強的抗氧化能力，具有優良的發酵特性和多種益生特性[4]，王英等[5]研究副干酪乳桿菌FM-LP-4 菌株在泡菜和酸奶發酵中的應用，結果表明，副干酪乳桿菌FM-LP-4發酵的蔬菜，其感官評分高于自然發酵蔬菜。與自然發酵蔬菜相比，縮短蔬菜的發酵時間，大大降低亞硝酸鹽含量，提高發酵蔬菜的抗氧化能力，因此，副干酪乳桿菌在發酵蔬菜中可以廣泛利用。副干酪乳桿菌具有良好的環境脅迫耐受能力，可以在pH 3.0和7.0%鹽度下仍能夠保持良好的生長能力[6]。這也充分說明副干酪乳桿菌可以是很好的蔬菜發酵菌株。

保藏菌種是使菌種不生長、不死亡處于休眠狀態，也保持不被污染，不降低、不喪失其優良性[7]。菌種基本保藏方法有[8-11]：①低溫定期移植保藏法、②液體石蠟保藏法、③冷凍干燥保藏法和④液氮超低溫保藏法。其中第①種低溫定期移植保藏法中的斜面培養由于斜面培養基與空氣接觸面大不適合培養兼性厭氧菌；液體培養必須用試管架豎直擺放，保藏占用的空間較大；穿刺培養在菌種活化時不是很方便操作；再者由于乳酸菌產酸，保藏一段時間會被乳酸滅活，保藏時間短[12-13]，通常2～3個月就得傳代轉管，菌種傳代頻繁，菌種變異頻率較高，活力減弱[14]。第②種液體石蠟保藏操作復雜，不適合中小企業應用。第③和第④種保藏方法技術含量高，設備投入高，運行成本高，只適合專業保藏機構使用，不適合生產企業使用。基于以上原因急需研究一種適合企業使用的簡單方便的菌種保藏方法。

為了適應發酵蔬菜生產企業菌種保藏，本研究采用白菜幫顆粒作為菌種保藏載體，探討白菜幫顆粒滅菌時間，在單因素試驗基礎上，通過響應面法優化改良MRS培養基配方。旨在為發酵蔬菜廠家（如酸菜廠、泡菜廠）提供一種操作簡單實用、保藏時間長、菌種質量穩定可靠、保藏成本低的乳酸菌菌種保藏方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）：本實驗室保藏；白菜：購于超市。

1.1.2 化學試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、檸檬酸二銨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、瓊脂：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基[15]、馬丁氏培養基[15]、改良MRS培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SX-500型全自動高溫高壓滅菌鍋：日本TDMYKOGYO公司；SHP-150恒溫培養箱：上海精宏設備有限公司；Z-16PK高速離心機：美國Sigma公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州進化設備有限公司；JA2003電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基質滅菌時間的選擇

由于本研究主要是給北方酸菜廠提供乳酸菌菌種保藏方法，又因白菜幫內部含有大量微管束，內表面積大，利于吸附微生物細胞，是一種理想菌種保藏包埋劑。故采用白菜幫作為菌種保藏載體。為了保有白菜幫的吸附能力，白菜幫顆粒滅菌時間不能太長，不能直接入MRS培養基中一起滅菌，所以首先確定載體白菜幫顆粒滅菌時間。將滅菌白菜幫顆粒和MRS培養基[14]混合再培養菌種，這就需要確定白菜幫顆粒的滅菌時間。

把白菜幫切成＜0.5 cm3小顆粒，洗凈，晾干表面水分，放入三角瓶中在121 ℃，滅菌3 min、5 min、7 min、9 min、12 min、15 min，將滅菌基質顆粒在無菌條件下分別放入到液體牛肉膏蛋白胨培養基和液體馬丁氏培養基中，培養液分別在37 ℃和28 ℃、180 r/min搖床培養24 h和72 h，采用平板計數法，看是否有雜菌生長，確定滅菌時間。

1.3.2 分析檢測

雜菌計數：平板計數法[15]；乳酸菌數的測定[16]：按國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》執行。

1.3.3 改良MRS培養基配方優化單因素試驗

以MRS液體培養基為基礎，適量加入白菜幫顆粒。乳酸菌菌數為評價指標，采用單因素試驗確定蛋白胨（4 g/L、6g/L、8g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L），牛肉膏（4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L），葡萄糖（8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L、24 g/L、28 g/L），白菜幫顆粒（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）4個因素的添加量。

1.3.4 改良MRS培養基配方優化響應面優化試驗[17-18]

根據單因素試驗結果，以蛋白胨（A）、葡萄糖（B）、牛肉膏（C）和白菜幫顆粒（D）添加量為影響因素，以乳酸菌菌數（Y）為響應值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設計4因素3水平Box-Behnken響應面試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

1.3.5 菌種保藏

上述培養好的菌種5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，把離心管的蓋子換成滅過菌的紗布塞，放入干燥箱42 ℃干燥2 h，然后無菌條件下轉入無菌EP管，每個管里放入2粒培養好的白菜幫顆粒，置于冰箱中于4 ℃或-18 ℃保藏，每年檢測乳酸菌菌數，并做雜菌檢測，累計檢測5年。

2 結果與分析

2.1 基質滅菌時間選擇

基質滅菌時間對細菌和霉菌生長的影響，結果見表2。

表2 基質滅菌時間對細菌和霉菌生長的影響Table 2 Effects of sterilization time of substrate on the growth of bacteria and mold

從表2可以看出，在121 ℃條件下滅菌9 min時，平皿中細菌和霉菌都不生長，此時白菜幫顆粒也能保持良好狀態，所以選擇9 min作為白菜幫顆粒基質滅菌時間。

2.2 改良MRS培養基配方優化單因素試驗

改良MRS培養基配方優化單因素試驗結果見圖1。

圖1 改良MRS培養基配方優化單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor experiments for modified MRS medium formula optimization

由圖1A可知，當蛋白胨添加量為4～8 g/L時，乳酸菌數隨之增加；當蛋白胨添加量為8 g/L時，乳酸菌數最高達1.17×1010CFU/mL；當蛋白胨添加量為8～14 g/L時，乳酸菌數隨之下降。因此，最適蛋白胨添加量為8 g/L。由圖1B可知，當牛肉膏添加量為4～8 g/L時，乳酸菌數隨之增加；當牛肉膏添加量為8g/L時，乳酸菌菌數最高達1.15×1010CFU/mL；當牛肉膏添加量為8～14 g/L時，乳酸菌數隨之下降。因此，最適牛肉膏添加量為8 g/L。由圖1C可知，當葡萄糖添加量為8～12 g/L時，乳酸菌數隨之增加；當葡萄糖添加量為12 g/L時，乳酸菌數最高達1.10×1010CFU/mL；當葡萄糖添加量為12～28 g/L時，乳酸菌數隨之下降。因此，最適葡萄糖添加量為12 g/L。由圖1D可知，當白菜幫顆粒添加量為10～25 g/L時，乳酸菌數隨之增加；當白菜幫顆粒添加量為25 g/L時，乳酸菌數最高達1.15×1010CFU/mL；當白菜幫顆粒添加量為25～35 g/L時，乳酸菌數隨之下降。因此，最適白菜幫顆粒添加量為25 g/L。這個結果與李小艷等[23-24]的結果基本一致。

2.3 改良MRS培養基配方優化響應面試驗

2.3.1 響應面法優化試驗結果

在單因素試驗基礎上，以蛋白胨（A）、葡萄糖（B）、牛肉膏（C）和白菜幫顆粒（D）添加量為影響因素，以乳酸菌菌數（Y）為響應值，運用Box-Benhnken 設計29 組試驗。Box-Benhnken 試驗設計及結果見表3。

表3 改良MRS培養基配方優化Box-Benhnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments for modified MRS medium formula optimization

續表

用Design-Expert 8.0.6軟件對表3的結果進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為：Y=+117.65+2.70A+2.37B+1.60C+1.58D+2.10AB-0.20AC+1.17AD+0.35BC+0.49BD-0.66CD-4.94A2-3.07B2-3.99C2-3.68D2

2.3.2 響應面試驗結果回歸模型方差分析

響應面試驗結果回歸模型方差分析見表4。由表4可知，該回歸模型P＜0.000 1，表明試驗所采取的二次模型極顯著，失擬項的P=0.502 2＞0.05，模型失擬項不顯著，表明該模型在統計學上是有意義的[19-20]。該模型的決定系數R2=0.956 9，校正決定系數R2adj=0.913 8，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好[21-22]。從P值結果可知，一次項A、B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AB對乳酸菌數的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。從F值結果可知，影響乳酸菌數的順序為蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞牛肉膏添加量＞白菜幫顆粒添加量。

表4 Box-Benhnken試驗結果的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model for Box-Benhnken experiments

2.3.3 響應面交互作用分析

采用Design-Expert8.0.6軟件繪制各因素兩兩之間交互作用響應面及等高線見圖2。

圖2 各因素交互作用對乳酸菌數影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the number of lactic acid bacteria

響應面曲面傾斜程度表示各因素對響應值的影響程度，二者成正比關系[23-24]；從等高線的形狀中可觀察交互效應強弱程度，橢圓則為交互作用顯著，圓形為交互作用不顯著[25]。由圖2可知，AB等高線基本接近橢圓形，故葡萄糖蛋白胨兩因素之間交互作用對乳酸菌數影響顯著，其他各因素兩兩之間對乳酸菌數影響不顯著。這結果與表4中結果回歸方程模型分析的結果一致，這充分說明此回歸方程模型可信。

2.3.4 驗證試驗

響應面試驗結果最佳改良MRS培養基配方為：蛋白胨8.85 g/L，葡萄糖14.27 g/L，牛肉膏8.38 g/L，白菜幫顆粒26.52g/L。在此條件下，乳酸菌數理論值為119.28×108CFU/mL。為了方便實際操作，將改良MRS培養基配方調整為：蛋白胨9 g/L，葡萄糖14 g/L，牛肉膏8 g/L，白菜幫顆粒25 g/L，按此優化條件進行3次平行驗證試驗，測得乳酸菌數實際值為119.87×108CFU/mL，與預測值的相對誤差為0.49%，說明方程擬合較好，響應面優化得到的培養基配方參數準確，具有實用價值。

2.4 菌種保藏結果

由圖3可知，4 ℃冷藏條件下3年內乳酸菌菌數為50×108CFU/mL以上，在-18 ℃冷凍條件下乳酸菌菌數5年內還能達到50×108CFU/mL，-18 ℃冷凍條件保藏菌種優越于4 ℃冷藏保存。兩種溫度保藏的乳酸菌菌種均沒有檢出雜菌。這兩種溫度下保藏乳酸菌菌種都適用于蔬菜發酵企業生產應用。

圖3 不同保藏時間對乳酸菌數的影響Fig.3 Effect of different preservation time on lactic acid bacteria

3 結論

生產菌種保藏對發酵蔬菜的生產有重要的意義，本試驗通過對副干酪乳桿菌培養載體的滅菌時間的確定和改良MRS培養基配方的響應面優化，得出培養基質白菜幫顆粒滅菌時間為9 min，最佳培養基配方為白菜幫顆粒25g/L、蛋白胨9 g/L、牛肉膏8 g/L、葡萄糖14 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、酵母膏5 g/L、乙酸鈉2 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、蒸餾水1 L。在上述培養基條件下副干酪乳桿菌的菌數為1.19×1010CFU/mL。

此方法保藏副干酪乳桿菌于冰箱中，1～4 ℃冷藏可保藏3～4年，-16～-20 ℃冷凍可保藏4～5年。此方法簡單易于操作又可以長期保持乳酸菌，適合發酵蔬菜生產企業乳酸菌菌種保藏。