解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)粗提取的優(yōu)化及分析

蘭寶鋒，王 睿，何 雙，周禮芹，蒙健宗*

（1.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530007）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有大分子抗菌蛋白類(lèi)和小分子抑菌肽類(lèi)細(xì)菌素如表面活性素（Surfactin）、枯草素（Iturin）與豐原素（Fengucin）[1]。由于近幾年抗生素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的大量使用，導(dǎo)致寄生植物的微生物與動(dòng)物體內(nèi)的微生物產(chǎn)生相應(yīng)耐藥性，而小分子抑菌肽類(lèi)細(xì)菌素具有綠色、無(wú)毒、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)被當(dāng)成替代抗生素的主要物質(zhì)之一。解淀粉芽孢桿菌作為一種高效的生防菌已被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)、植物病蟲(chóng)害以及水果保鮮等領(lǐng)域[2-5]。由于小分子抑菌肽類(lèi)產(chǎn)量低、提取方法復(fù)雜以及生產(chǎn)成本較高等因素制約其商業(yè)化的應(yīng)用[6]。抑菌物質(zhì)的粗提取是為后續(xù)進(jìn)一步分離純化獲得單一抗菌物質(zhì)、研究其特定結(jié)構(gòu)的重要一步。

目前，粗提抑菌物質(zhì)的方法主要有硫酸銨鹽析[7]、有機(jī)溶劑萃取法[8]、酸沉淀法[9]以及凝膠柱層析法[10]等。硫酸銨鹽析作為一種使用最為廣泛的方法不僅可以保持蛋白或多肽的抑菌活性，而且成本低廉、操作簡(jiǎn)單[11]。例如王偉等[12]利用70%硫酸銨鹽析粗提法提取出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）W5所產(chǎn)的約12.3 kDa的細(xì)菌素；ZIMINA M I等[13]將培養(yǎng)18 h的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨沉淀后，其細(xì)菌素的抑菌活性最高；PERUMAL V I等[14]將貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）發(fā)酵液經(jīng)80%飽和硫酸銨鹽析后，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析得到6.5 kDa的細(xì)菌素。有機(jī)溶劑萃取法具有高效便捷、無(wú)殘留、可蒸發(fā)去除等優(yōu)點(diǎn)也作為常用的提取方法之一。花榜清[15]將牛類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus bovissp.nov）發(fā)酵液利用乙酸乙酯、正丁醇、氯仿和石油醚四種有機(jī)溶劑萃取細(xì)菌素，比較后得出利用正丁醇的萃取效果最佳，且經(jīng)過(guò)8次萃取之后，樣品已基本無(wú)抑菌活性；YANG D等[16]利用甲醇從類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus）JSa-9發(fā)酵液中提取出對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均有抑制作用的3種拮抗化合物；樊麗娟等[17]利用乙酸乙酯和氯仿對(duì)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行萃取，經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，乙酸乙酯萃取物中存在10種獨(dú)有化合物，而氯仿萃取物中存在11種獨(dú)有化合物。酸沉淀法是利用上清液pH環(huán)境改變時(shí)對(duì)周邊蛋白質(zhì)吸附能力的改變來(lái)粗提抑菌物質(zhì)。許亦峰等[18]利用酸沉淀法粗提枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵液，所得細(xì)菌素粗產(chǎn)物的效價(jià)是硫酸銨沉淀法的2倍，并且其產(chǎn)物的比活力提高了55.46%。不同的粗提方法對(duì)于后續(xù)分離純化抗菌肽均有不同的影響，需要根據(jù)抑菌肽的性質(zhì)與純化的目的來(lái)決定。不同抑菌物質(zhì)的粗提方法將會(huì)直接影響后續(xù)的純化效率。

前期已篩選得到的一株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌，為探究粗提抑菌物質(zhì)的最適方法，本研究利用硫酸銨沉淀法、酸沉淀法、乙酸乙酯萃取法、甲醇抽提法以及凝膠過(guò)濾層析法對(duì)抑菌物質(zhì)的粗提取與分析，為后續(xù)抑菌物質(zhì)的進(jìn)一步純化及結(jié)構(gòu)鑒定提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）A13：本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；大腸桿菌（Escherichia coli）：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京Solarbio科技有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸乙酯（均為分析純）：天津市北辰方正試劑廠；鹽酸（分析純）：廉江市愛(ài)廉化試劑有限公司；硫酸銨（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；甲醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Tris（Ultra Pure）：北京酷來(lái)博生物科技有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）、Bradford工作液：上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及Buffer的配制

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，去離子水1 L，pH值調(diào)至6.5。121 ℃滅菌20 min。

LB半固體（軟瓊脂）培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉8.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1 mol/L Tris-HCl：121.1 g Tris，加超純水約900 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0，后定容至1 L，置于4 ℃冰箱，備用。

Buffer A：37.5 mL 4 mol/L NaCl，20 mL 1 mol/L Tris-HCl，加超純水定容至1 L，pH值調(diào)至7.5，過(guò)0.22 μm濾膜并超聲30 min，置于4 ℃冰箱，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP電子天平、PB-10酸度計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：南京菲奇工貿(mào)有限公司；85-2B恒溫磁力攪拌器：江蘇金怡儀器有限公司；YM50 50L立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海高致精密儀器有限公司；J-26S XP高效離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特（美國(guó)）股份有限公司；xiande-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；瑞士InfiniteF200多功能酶標(biāo)儀：上海艾研生物科技有限公司；FD5-5安瓿凍干系統(tǒng)：西盟（美國(guó)）國(guó)際集團(tuán)公司；SuperdexTM75凝膠層析柱（10 mm×310 mm，13 μm）：上海基星生物科技有限公司；AKTA pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)：美國(guó)Cytiva公司；GYCX-1450多功能層析柜：廈門(mén)國(guó)儀科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵上清液的制備[19]

將經(jīng)過(guò)37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h的解淀粉芽孢桿菌A13發(fā)酵上清液經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心10 min，去沉淀，即得解淀粉芽孢桿菌A13的發(fā)酵上清液。

1.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

使用改良牛津杯法[20]，即將滅菌的牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm）放置無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入含有大腸桿菌菌液的LB軟瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用無(wú)菌鑷子取出牛津杯，即形成孔洞，再向孔洞中加入100 μL試驗(yàn)樣品，待樣品風(fēng)干后，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使用直尺測(cè)量其抑菌圈直徑，直徑＞8 mm表明具有抑菌活性，直徑越大說(shuō)明抑菌效果越強(qiáng)。

1.3.3 細(xì)菌素粗提液的制備

（1）硫酸銨鹽析法[21]

將硫酸銨固體緩慢加入100 mL發(fā)酵上清液中，使溶液中硫酸銨飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，在25 ℃下充分溶解后，轉(zhuǎn)移至冷庫(kù)（10 ℃）攪拌過(guò)夜，再經(jīng)過(guò)8 000 r/min 離心20 min，去上清留沉淀，向沉淀中加入10 mL的Buffer A復(fù)溶，再次8 000 r/min離心10 min，將上清液過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，透析后并做抑菌驗(yàn)證，選取抑菌效果最佳的樣品儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱并做后續(xù)試驗(yàn)。

（2）酸沉淀法[22]

將100 mL發(fā)酵上清液分為A與B組分別至于燒杯中，將其pH值調(diào)至2.0，放置4 ℃冰箱中過(guò)夜。A組先以8 000 r/min離心20 min后用10 mL Buffer A復(fù)溶，再用3 mol/L NaOH調(diào)pH值至中性；B組先用3 mol/L NaOH調(diào)pH值至中性，再以8 000 r/min離心20 min后用10 mL Buffer A復(fù)溶。兩組復(fù)溶樣品均過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜并做抑菌驗(yàn)證，選取最佳組存于-20 ℃冰箱并做后續(xù)試驗(yàn)。

（3）甲醇抽提法[23]

將100 mL發(fā)酵上清液預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)中，待其形成凍干粉后取出，加入與發(fā)酵上清液等體積的甲醇在磁力攪拌器上抽提6 h，結(jié)束后過(guò)0.22 μm濾膜并做抑菌驗(yàn)證，同時(shí)以甲醇為陰性對(duì)照做抑菌驗(yàn)證。再將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50 ℃、50 r/min條件下進(jìn)行蒸干，再用10 mL Buffer A進(jìn)行復(fù)溶，再次過(guò)無(wú)菌濾膜，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（4）乙酸乙酯萃取法[24]

將100 mL發(fā)酵上清液置于燒杯中，按乙酸乙酯與發(fā)酵上清液體積比為0.5∶1.0、1.0∶1.0、2.0∶1.0、3.0∶1.0（V/V）進(jìn)行萃取，攪拌均勻后，室溫放置過(guò)夜，吸出有機(jī)相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50 ℃、50 r/min條件下進(jìn)行蒸干，再用10 mL Buffer A進(jìn)行復(fù)溶并過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜進(jìn)行抑菌驗(yàn)證，選擇抑菌效果最佳比例樣品存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 粗提液回收率的計(jì)算

將硫酸銨鹽析法、酸沉淀法、乙酸乙酯萃取法以及甲醇抽提法的粗提無(wú)菌濾液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以初始發(fā)酵上清液作為對(duì)照進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)其抑菌圈直徑大小。以抑菌圈面積比作為回收率值。具體公式如下：

式中：10為濃縮倍數(shù)；4為牛津杯外徑半徑，mm；R為粗提液抑菌圈半徑，mm；r為發(fā)酵上清液抑菌圈半徑，mm。

1.3.5 粗提液抑菌蛋白含量的測(cè)定[25]

分別配制不同濃度的牛血清蛋白（BSA）溶液，分別吸取BSA溶液與待測(cè)樣品20 μL至96孔板中，再加入200 μL的Bradford工作液，反應(yīng)5 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔在波長(zhǎng)600 nm條件下的吸光度值。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，各孔在波長(zhǎng)600 nm條件下的吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，取平均值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.6 凝膠過(guò)濾層析分離純化[26]

先用超純水洗蛋白純化系統(tǒng)與SuperdexTM75凝膠層析柱，再用Buffer A進(jìn)行洗脫平衡后，分別將硫酸銨鹽析法、酸沉淀法、乙酸乙酯萃取法以及甲醇抽提法的粗提備用液1 mL以1 mL/min的流速加入SuperdexTM75 層析柱中，以Buffer A作為梯度洗脫液，洗脫樣品并在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)蛋白圖譜。收集出峰位置的每管洗脫液以大腸桿菌為指示菌按1.3.2方法做抑菌驗(yàn)證。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后，用Origin 9.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硫酸銨飽和度鹽析對(duì)抑菌活性的影響

發(fā)酵上清液經(jīng)不同硫酸銨飽和度鹽析后得到的粗提細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑菌活性見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵液中硫酸銨飽和度為10%時(shí)，經(jīng)過(guò)離心后其基本無(wú)沉淀，且經(jīng)Buffer復(fù)溶后沒(méi)有抑菌活性。當(dāng)硫酸銨飽和度為20%～80%時(shí)，出現(xiàn)顯著的抑菌活性，并且隨著硫酸銨飽和度的增大，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為15.33 mm、16.73 mm、17.67 mm、20.76 mm、20.67 mm、23.33 mm。當(dāng)硫酸銨飽和度為80%時(shí)，其抑菌活性達(dá)到最大值，抑菌圈直徑為23.67 mm。因此，選擇硫酸銨飽和度為80%。

圖1 不同硫酸銨飽和度對(duì)抑菌物質(zhì)粗提的影響Fig.1 Effect of different ammonium sulfate saturation on the crude extraction of antibacterial substances

2.2 酸沉淀操作方法的抑菌活性比較

酸沉淀的兩組操作方法得到的抑菌活性見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)以酸沉淀A組操作方法粗提抑菌物質(zhì)時(shí)，其抑菌活性都在產(chǎn)生的沉淀中，而此時(shí)中性的發(fā)酵上清已經(jīng)完全沒(méi)有抑菌活性。當(dāng)以B組操作方法進(jìn)行粗提時(shí)，pH值先調(diào)至中性，其產(chǎn)生的沉淀又會(huì)立刻溶解，只能離心出少量沉淀，且沉淀沒(méi)有抑菌活性。并且經(jīng)過(guò)A組方法得到的粗提物的抑菌圈直徑為22.67 mm顯著強(qiáng)于B組上清的抑菌圈直徑15.1 mm。因此，當(dāng)以酸沉淀方法提取抑菌物質(zhì)時(shí)，酸沉淀靜置過(guò)夜后應(yīng)當(dāng)先離心復(fù)溶后，再將pH調(diào)至中性，方能得到粗提抑菌活性高的物質(zhì)。

圖2 兩組酸沉淀方法的比較Fig.2 Comparison of two groups of acid precipitation methods

2.3 不同比例乙酸乙酯萃取對(duì)抑菌效果的影響

不同比例乙酸乙酯萃取對(duì)粗提物抑菌效果的比較見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著乙酸乙酯的比例逐漸增大，其抑菌效果也不斷增強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為18.7 mm、23.9 mm、25.0 mm。當(dāng)乙酸乙酯與上清液的體積比為3∶1時(shí)，其萃取出的有機(jī)相抑菌效果最顯著，抑菌圈直徑達(dá)到25.5 mm，但是在萃余相中也還存在抑菌效果。說(shuō)明當(dāng)其乙酸乙酯與上清液的體積比為3∶1時(shí)，并沒(méi)有完全萃取出其抑菌物質(zhì)。因此，再次加入3倍體積的乙酸乙酯至萃余相中進(jìn)行二次萃取，有機(jī)相中的抑菌效果明顯減弱，并且萃余相中仍然存在一些抑菌效果，說(shuō)明經(jīng)過(guò)二次萃取后，仍有殘留抑菌物質(zhì)未被萃取出。

圖3 不同比例乙酸乙酯萃取對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Effect of different proportion of ethyl acetate extraction on antibacterial effect

2.4 粗提液回收率及蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

四種方法粗提抑菌活性的回收率及蛋白質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。由表1可知，四種不同方法對(duì)等體積發(fā)酵液的粗提，四種粗提液的回收率均處于較低水平，且蛋白質(zhì)量濃度也存在較大的差異。從粗提液的回收率看，甲醇抽提法效果最佳，其回收率達(dá)到32.1%，且以甲醇為陰性對(duì)照組中無(wú)抑菌圈出現(xiàn)，乙酸乙酯回收率為23.6%，硫酸銨飽和度為80%回收率為17.8%，酸沉淀法所得回收率最低，為13.7%。對(duì)粗提抑菌物質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.002 9x+0.463 2（R2=0.993 5）進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)過(guò)同等體積發(fā)酵液與Buffer A復(fù)溶后，硫酸銨飽和度為80%鹽析的蛋白質(zhì)量濃度最高，達(dá)到582.50 μg/mL，甲醇抽提效果次之，蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到505.00 μg/mL，乙酸乙酯的蛋白質(zhì)量濃度最低，為255.20 μg/mL。雖然該解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液用甲醇抽提法提取出的蛋白質(zhì)量濃度比硫酸銨鹽析法低，但抑菌效果更強(qiáng)，可能是由于甲醇粗提法中所提取出的蛋白質(zhì)中含有更多的抑菌成分。

表1 不同提取方法的粗提液回收率、蛋白含量及其抑菌效果的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of the recovery rate,protein content and antibacterial effect of crude extract by different extraction methods

2.5 粗提液的凝膠層析及洗脫液的抑菌活性

SuperdexTM75凝膠層析柱是一種能進(jìn)行高效分離蛋白、多肽等物質(zhì)的分離柱，不僅能分離小分子物質(zhì)（分子質(zhì)量3 000 Da），也能分離大分子物質(zhì)（分子質(zhì)量70 000 Da），因此被廣泛運(yùn)用于蛋白與多肽類(lèi)物質(zhì)的分離純化。根據(jù)前期準(zhǔn)備好的發(fā)酵液粗提液，分別進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析后，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，四種粗提液進(jìn)行分離后其分離效果具有較大差異。當(dāng)經(jīng)過(guò)硫酸銨飽和度為80%鹽析法進(jìn)行初步分離時(shí)，其吸收峰數(shù)較多且較為集中；由圖4B可知，當(dāng)經(jīng)過(guò)酸沉淀法進(jìn)行初步分離時(shí)，其吸收峰數(shù)較多，洗脫出較多物質(zhì)；由圖4C可知，當(dāng)用甲醇抽提法進(jìn)行初步分離時(shí)，其吸收峰數(shù)明顯減少，且峰與峰之間分離效果較好；由圖4D可知，當(dāng)用乙酸乙酯萃取法進(jìn)行初步分離時(shí)，其吸收峰均尖銳且連續(xù)。

圖4 四種萃取方法粗提液SuperdexTM75凝膠柱層析色譜圖Fig.4 SuperdexTM75 gel column chromatography of crude extract by four kinds of extraction methods

將四種粗提液進(jìn)行凝膠柱層析后的洗脫液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)用硫酸銨飽和度為80%鹽析法的所有洗脫液中，2～8號(hào)管中具有顯著抑菌效果，16～20號(hào)管有較弱的抑菌效果；酸沉淀法的所有洗脫液進(jìn)行抑菌驗(yàn)證時(shí)，基本無(wú)抑菌效果，只有少數(shù)收集管中存在抑菌效果且其抑菌效果不明顯；當(dāng)用甲醇抽提法的所有洗脫液進(jìn)行抑菌驗(yàn)證，在第2、第50號(hào)收集管中具有顯著抑菌效果，第3、第34與第54號(hào)收集管中存在較弱的抑菌效果；當(dāng)用乙酸乙酯法的所有洗脫液進(jìn)行抑菌驗(yàn)證后，在第37、第92號(hào)管中有顯著抑菌效果，還有少數(shù)收集管中存在不明顯的抑菌效果。因此，通過(guò)對(duì)四種方法的所有洗脫液進(jìn)行抑菌驗(yàn)證后，抑菌物質(zhì)被先后分離出的粗提方法為硫酸銨鹽析法、甲醇抽提法、乙酸乙酯萃取法、酸沉淀法，且以硫酸銨鹽析法分離出的抑菌活性物質(zhì)最多。此外，以硫酸銨鹽析法粗提抑菌物質(zhì)時(shí)，被分離出的抑菌活性物質(zhì)主要分布在兩個(gè)區(qū)域，說(shuō)明以硫酸銨鹽析法粗提出的抑菌物質(zhì)至少為兩種。

表2 四種提取方法洗脫液抑菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of bacteriostatic verification tests of eluent by four kinds of extraction methods

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以解淀粉芽孢桿菌A13為研究對(duì)象，通過(guò)硫酸銨鹽析法、酸沉淀法、甲醇抽提法和乙酸乙酯萃取法進(jìn)行發(fā)酵液的粗提取及優(yōu)化，結(jié)果表明以硫酸銨鹽析對(duì)粗提液得制備時(shí)，硫酸銨飽和度為80%的蛋白質(zhì)量濃度最高為582.50 μg/mL，其回收率為17.8%，抑菌圈直徑為23.67 mm。當(dāng)發(fā)酵上清液以硫酸銨鹽析法粗提時(shí)，使用SuperdexTM75凝膠層析柱可以有效地優(yōu)先洗脫出抑菌物質(zhì)，且至少能分離出兩種抑菌物質(zhì)。由于解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為肽類(lèi)及蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)，因此，硫酸銨鹽析法為粗提解淀粉芽孢桿菌A13抑菌物質(zhì)的合適方法。