酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖工藝優(yōu)化

劉媛潔，張 良

（1.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 臨床醫(yī)學(xué)院，江西 上饒 334099；2.江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336023）

青錢柳（Cyclocarya paliurus）又名搖錢樹，是中國特有、國家二級(jí)保護(hù)的珍惜樹種，廣泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地[1-2]。青錢柳葉中含有黃酮、多糖、三萜、有機(jī)酸類等多種天然功能性活性物質(zhì)[3-4]，在降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效[5-7]。基于青錢柳葉的藥食兼用的價(jià)值，青錢柳葉茶已通過美國食品藥品管理局的認(rèn)證，青錢柳葉已列入中國新資源食品原料目錄[8-9]。青錢柳干燥葉片中多糖含量范圍為0.93%～5.36%[10-11]，青錢柳多糖是青錢柳葉中主要的活性物質(zhì)之一，也是目前研究較多的青錢柳活性物質(zhì)[12-14]。謝建華等[15]利用熱水浸提法提取青錢柳多糖，其提取率為6.54%。李彥坡等[1]利用超聲波輔助微波提取法提取青錢柳多糖，提取率為10.02%。胡文兵等[16]利用超聲波輔助復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）法提取青錢柳多糖，其提取率為7.18%。魯青等[17]采用微生物發(fā)酵法（黑曲霉（Aspergillus oryzae）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis））同步提取青錢柳多糖，其提取率為7.57%，較優(yōu)化前增加50.50%。

酶菌協(xié)同發(fā)酵是指原料經(jīng)酶解工藝后，再經(jīng)微生物菌種發(fā)酵的過程[18]。酶解是利用纖維素酶和半纖維素酶的高效專一性破壞分解植物細(xì)胞等組織結(jié)構(gòu)，提高目標(biāo)天然活性物質(zhì)的溶出量[19]，但不能解決青錢柳特有的苦澀味問題[17]。微生物發(fā)酵是通過菌種生長過程中產(chǎn)生各種酶系提高目標(biāo)天然活性物質(zhì)的溶出量[20]，此外，益生菌等菌種發(fā)酵不僅會(huì)產(chǎn)生功能性代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)，也可以去除青錢柳的苦澀味[21]，但存在發(fā)酵酶系活力和酶量不足的問題。

本研究以產(chǎn)自江西九江修水縣的青錢柳葉為原料，選用纖維素酶和半纖維素酶對(duì)青錢柳葉進(jìn)行酶解，以高產(chǎn)纖維素酶的粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為發(fā)酵菌種對(duì)其酶解液進(jìn)行發(fā)酵，以青錢柳多糖的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。以期獲得青錢柳多糖含量較高、適口性好的發(fā)酵型青錢柳飲品，為青錢柳葉的精深加工和高值化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

青錢柳葉：產(chǎn)自江西九江市修水縣；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：由江西省食品發(fā)酵研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑

半纖維素酶（酶活100 000 U/g）、纖維素酶（酶活20 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；硫酸、苯酚（均為分析純）：天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：南通三思機(jī)電有限公司；FA1204電子天平：上海精科天美有限公司；YDJ-200B恒溫?fù)u床：英檢達(dá)儀器（重慶）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的制備

挑取4環(huán)斜面保藏的粗糙脈孢菌接種到裝液量為80 mL/250 mL的PDB培養(yǎng)基中，搖床（30 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h，制備粗糙脈孢菌種子液；挑取4環(huán)斜面枯草芽孢桿菌接到裝液量為80 mL/250 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，搖床（35 ℃，140 r/min）培養(yǎng)18 h，得到枯草芽孢桿菌種子液。

1.3.2 青錢柳多糖的制備

取干燥粉碎后過20目篩的青錢柳葉，設(shè)置裝料量為6.0 g/250 mL，按照料液比6∶100（g∶mL），加入蒸餾水后搖勻。按照青錢柳葉細(xì)粉質(zhì)量的0.6%添加復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比為1∶1），在55 ℃下恒溫水浴酶解3.0 h后，在100 ℃下滅酶活20 min。按照酶解液后原料總質(zhì)量的8%添加蔗糖，經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻，按照酶解液原料總質(zhì)量的4%接種混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比為1∶1）種子液，置于恒溫?fù)u床（32℃，140 r/min）培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液在5 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min后，取上清液，檢測發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量。

1.3.3 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

按照1.3.2的工藝條件，固定單因素試驗(yàn)條件為：料液比6∶100（g∶mL）、復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶添加量0.6%、酶解時(shí)間3.0 h、蔗糖添加量8%、混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質(zhì)量比1∶1、混合菌接種量4%、發(fā)酵時(shí)間48 h。

以青錢柳多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察料液比（2∶100、4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶mL））、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、復(fù)合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、蔗糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、粗糙脈孢菌與枯草芽孢桿菌質(zhì)量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、混合菌接種量（2%、3%、4%、5%、6%）和發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）對(duì)青錢柳多糖含量的影響。

1.3.4 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以青錢柳多糖含量為響應(yīng)值，選取8個(gè)影響因素料液比（X1）、復(fù)合酶添加量（X2）、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（X3）、酶解時(shí)間（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、混合菌質(zhì)量比（X7）、發(fā)酵時(shí)間（X8），對(duì)8個(gè)因素的最優(yōu)發(fā)酵條件范圍分別取高、低兩個(gè)水平，運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量影響顯著的因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

（2）Box-Behnken試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量（Y）為響應(yīng)值，選擇對(duì)結(jié)果顯著性影響的因素纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）為自變量，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

1.3.5 青錢柳多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[22]測定多糖含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖1。由圖1可知，隨著料液比在2∶100～8∶100（g∶mL）范圍內(nèi)的逐漸增加，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈增加的趨勢；當(dāng)料液比為8∶100（g∶mL）時(shí)，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量達(dá)到最高值，為2.46 mg/mL；當(dāng)料液比為8∶100～12∶100（g∶mL）時(shí)，青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，料液比太小不利于青錢柳的充分發(fā)酵，而隨著料液比的增加，有利于多糖從組織細(xì)胞內(nèi)溶出到周圍溶液中，但過大的料液比也會(huì)造成有效成分損失，青錢柳葉干燥粉濃度相對(duì)降低進(jìn)而導(dǎo)致青錢柳多糖含量的減少[23]。因此，選擇最適的料液比為8∶100（g∶mL）。

圖1 料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著復(fù)合酶添加量在0.2%～0.8%范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.8%時(shí)，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.43 mg/mL；當(dāng)復(fù)合酶添加量＞0.8%之后，青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，復(fù)合酶添加量低時(shí)酶解不充分，青錢柳多糖和其他活性物質(zhì)等溶出較少，發(fā)酵液中營養(yǎng)元素不是發(fā)酵菌的最佳生長條件，導(dǎo)致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量較少；隨著復(fù)合酶添加量的增加，酶解效果較好，青錢柳多糖和其他活性物質(zhì)等溶出較高，但發(fā)酵菌生長較快，多糖等營養(yǎng)物質(zhì)消耗也較快，導(dǎo)致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量緩慢下降[24]。因此，選擇最適復(fù)合酶（纖維素酶與半纖維素酶）添加量為0.8%。

圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme addition on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.3 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖3。由圖3可知，隨著復(fù)合酶（纖維素酶與半纖維素酶）質(zhì)量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1的變化，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈上升趨勢；當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比為2∶1時(shí)，青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.35 mg/mL；當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比高于2∶1時(shí)，青錢柳多糖含量略有下降。分析原因可能是隨著纖維素酶質(zhì)量占比的增加，酶解出的青錢柳多糖含量等營養(yǎng)活性物質(zhì)逐漸增加，發(fā)酵菌在較低的纖維素酶質(zhì)量占比時(shí)，生長較慢，水解出的青錢柳多糖較少，但纖維素酶質(zhì)量占比較高時(shí)，發(fā)酵菌生長較快，消耗青錢柳多糖等營養(yǎng)物質(zhì)較快，青錢柳多糖含量略有降低[25]。因此，選擇最適纖維素酶與半纖維素酶質(zhì)量比為2∶1。

圖3 纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.3 Effect of cellulase and hemi cellulase mass ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖4。由圖4可知，隨著酶解時(shí)間在1.0～2.5 h范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈現(xiàn)增加的趨勢；當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.26 mg/mL。酶解時(shí)間＞2.5 h之后，青錢柳多糖含量下降。其原因可能是，青錢柳多糖會(huì)受酶解作用的影響發(fā)生部分水解，導(dǎo)致青錢柳多糖含量降低[26]。因此，選擇最適酶解時(shí)間為2.5 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖5。由圖5可知，隨著蔗糖添加量在4%～8%范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈先增加的趨勢；當(dāng)蔗糖添加量為8%時(shí)，青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.22 mg/mL；當(dāng)蔗糖添加量＞8%之后，青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是，作為培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高，發(fā)酵菌種細(xì)胞的滲透壓過大，菌體生長緩慢，導(dǎo)致青錢柳多糖含量降低[27]。因此，選擇最適的蔗糖添加量為8%。

圖5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.6 混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著混合菌添加量在2%～4%范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量增加；當(dāng)混合菌添加量為4%時(shí)，青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.22 mg/mL；當(dāng)混合菌添加量＞4%之后，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是，混合菌添加量過高，會(huì)使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足發(fā)酵菌種的生長，同時(shí)消耗培養(yǎng)基中的多糖等活性物質(zhì)滿足菌種的生長，導(dǎo)致發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量降低[28]。因此，選擇最適的混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）添加量為4%。

圖6 混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.6 Effect of mixed microbes addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.7 混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖7。由圖7可知，隨混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質(zhì)量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1范圍內(nèi)的變化，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當(dāng)混合菌質(zhì)量比為2∶1時(shí)，發(fā)酵液中

圖7 粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.7 Effect of Neurospora crassa and Bacillus subtilis mass ratio on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

青錢柳多糖含量達(dá)到最高值（2.36 mg/mL）；當(dāng)混合菌質(zhì)量比＞2∶1時(shí)，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。究其原因可能是，粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌在生長過程中，會(huì)分泌大量有利于粗纖維和木質(zhì)素降解的纖維素酶系和其他水解酶，有利于細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中多糖的釋放到發(fā)酵液中[29]。混合菌質(zhì)量比的不同，菌種自身生長和代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)不一樣，菌種間相互生長和代謝的制約程度不一樣[30]。因此，選擇最適的混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質(zhì)量比為2∶1。

2.1.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖8。由圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～60 h范圍內(nèi)的延長，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，青錢柳多糖含量達(dá)最大值，為2.56 mg/mL；發(fā)酵時(shí)間＞60 h后，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，發(fā)酵菌種進(jìn)入生長的衰老期，分泌的酶量不再增加，同時(shí)發(fā)酵菌產(chǎn)生了能降解青錢柳多糖的酶，使青錢柳多糖含量逐漸減低[31]。因此，選擇最適的發(fā)酵時(shí)間為60 h。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.2 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

（1）Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以青錢柳多糖含量（Y）為響應(yīng)值，選取8個(gè)因素料液比（X1）、復(fù)合酶添加量（X2）、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（X3）、酶解時(shí)間（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比（X7）、發(fā)酵時(shí)間（X8），按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同發(fā)酵條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見表4。

表3 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

由表4可知，模型的P值為0.015 1，表示該模型顯著（P＜0.05）；模型的決定系數(shù)R2=0.982 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.934 7，說明存在93.47%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋。從各因素的P值可以看出，纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（X3）對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著（P＜0.01），蔗糖添加量（X5）和混合菌添加量（X6）對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響顯著（P＜0.05）。因此，選擇纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比、蔗糖添加量和混合菌添加量3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman tests results

（2）Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定不顯著影響因素分別為料液比8∶100（g∶mL）、復(fù)合酶添加量0.8%、酶解時(shí)間2.5 h、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比2∶1、發(fā)酵時(shí)間60 h。以青錢柳多糖含量（Y）為響應(yīng)值，以纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)多元回歸擬合，得到模型的二次多項(xiàng)式方程為：

由表6可知，該模型P＜0.000 1，表明建立的模型極顯著（P＜0.01）；失擬項(xiàng)P值=0.401 2，不顯著（P＞0.05），表明建立的模型擬合度較好[32]；模型的決定系數(shù)R2為0.988 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.972 9，表明97.29%的響應(yīng)值變化能由該模型進(jìn)行解釋，實(shí)際試驗(yàn)與模型建立的方程擬合度較好，能用于分析和預(yù)測發(fā)酵液中青錢柳多糖的工藝優(yōu)化。由P值可知，一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著（P＜0.01），其他因素均不顯著（P＞0.05）。模型的F值越大對(duì)青錢柳多糖含量的影響越大[33]。由F值可知，各因素對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵青錢柳多糖含量的影響程度為：C（混合菌添加量）＞A（纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比）＞B（蔗糖添加量）。

各因素交互作用對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖影響的響應(yīng)面及等高線見圖9。

圖9 各因素間交互作用對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the contents of polysaccharide from Cyclocarya paliurus

自變量因素對(duì)響應(yīng)值的影響與響應(yīng)面坡度陡峭程度呈正相關(guān)[34]；等高線呈橢圓形的程度與兩個(gè)自變量交互作用的程度呈正相關(guān)[35]。由圖9可知，AB和BC的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響較大，隨著各因素?cái)?shù)值的增大，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，響應(yīng)面呈凸型陡峭曲面，對(duì)應(yīng)的等高線呈橢圓形，表明AB和BC的交互作用顯著（P＜0.05），青錢柳多糖含量存在極大值；而AC有交互作用，但不顯著（P＞0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型的回歸方程分析，獲得最佳的酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖工藝條件為：纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比1.8∶1.0、蔗糖添加量8.33%、混合菌添加量4.91%。在此最佳條件下，青錢柳多糖含量理論值可達(dá)3.35 mg/mL。考慮具體試驗(yàn)的可操作性，修正最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.8%、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%。在此優(yōu)化條件下，青錢柳多糖含量的實(shí)際值為3.34 mg/mL，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為0.30%，說明該模型準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

以發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖的工藝條件。最終確定最佳工藝條件為：料液比8∶100（mg∶mL）、復(fù)合酶添加量0.8%、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比1.8∶1.0、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比2∶1、發(fā)酵時(shí)間60 h。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為3.34 mg/L。該方法結(jié)合了酶解法和微生物發(fā)酵法，酶菌協(xié)同發(fā)酵克服了單一酶解時(shí)青錢柳有苦澀味問題和單一微生物發(fā)酵酶系不足等問題，顯著提高了青錢柳多糖的含量，可為青錢柳精深加工提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為青錢柳的高效利用開創(chuàng)了新的途徑，對(duì)制備適口性強(qiáng)和高含量青錢柳多糖的產(chǎn)品有一定的產(chǎn)業(yè)化意義。