不同方法提取香菇中揮發性成分的測定

連希希，孫佳寧，孫伶俐，劉 佳，王聯芝，段正超

（湖北民族大學 化學與環境工程學院，湖北 恩施 445000）

香菇作為一種藥食兩用菌有著廣泛的用途。在藥用方面，香菇中含有豐富的活性成分，在抗腫瘤、護肝、抗病毒、調節免疫力等方面有很好的功效[1-3]，因此人們對香菇在醫學領域的應用有著較深入的研究。在食用方面，香菇因其具有特殊的風味，深受人們的喜歡。鮮香菇高溫加工制作成干香菇時，碳水化合物經過熱降解、美拉德反應等化學變化從而產生香氣[4]，遺傳、生長環境等多種因素亦會影響香菇的香氣[5]。香菇的揮發性成分中，香味閾值以上的揮發性成分對風味起關鍵作用[6]。

香菇揮發性成分的萃取方法主要可分為兩大類：溶劑萃取法和頂空萃取法。LIAO P H等[7]利用同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）提取啤酒中的酯類化合物，發現該方法對設備要求簡單，成本較低，但對蒸氣壓低的組分萃取不完全；MILLER K G等[8]在實驗過程中發現，超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）無溶劑殘留，但是實驗過程中萃取物很容易將管路堵塞；FRANCHINA F A等[9]利用動態頂空吹掃-捕集技術對不同風味的啤酒進行鑒定，此方法可以減少熱不穩定物質的分解，但操作繁瑣、成本高；PAIVA A C等[10]綜述了頂空固相微萃取（head space solid phase micro-extraction，SPME）對環境、食品、生物等樣品的萃取，操作方便、重復性好、檢測限可達到ng/g～pg/g級別，但分析結果受吸附頭的影響較大。頂空固相微萃取（HS-SPME）是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，操作簡單、克服了固相萃取吸附劑孔道易堵塞缺點的萃取方法[11]。煎煮法和水蒸氣蒸餾法對設備的要求較低，操作過程更加方便、簡單，所需試劑無毒無害，提高了其應用效率。樣品只需經過簡單的處理便可利用HS-SPME進行富集。

揮發性成分常見的檢測方法有：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術[12]、電子鼻技術[13]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術[14]。其中HPLC法操作簡單、進樣量小、檢測準確性高；電子鼻可以通過傳感器監測成分的微小變化，反映樣品中整體揮發性化合物的信息，但傳感器具有選擇性、限制性，因此對于不同化合物需要更換不同傳感器，成本較高。GC-MS可用于痕量物質分析，檢測靈敏度高，消耗溶劑少，但在進行分析前需要進行復雜的處理，所用時間較長[15]。

因此本實驗分別采用煎煮法、水蒸氣蒸餾法處理干香菇，兩種方法得到的香菇提取液的揮發性化合物的比較未見報道，特采用HS-SPME-GC-MS對干香菇游離態、鍵合態揮發性進行分析比較，為香菇的風味研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇：武漢海芳工貿發展有限公司。

正戊烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、二氯甲烷、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氯化鈉（均為分析純）、仲辛酮（純度≥99.9%）：國藥集團化學試劑有限公司；安博萊特（Amberlite）XAD-2大孔吸附樹脂（粒徑0.25～0.83 mm）：美國Supelco公司；纖維二糖酶（130 U/g）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇提取液的制備

取100.0 g干香菇菌蓋置于粉碎機內粉碎，稱取等量45.0 g香菇粉末分別放于兩個三頸燒瓶中，分別采用煎煮法和水蒸氣蒸餾法提取5 h，冷卻，減壓過濾，分別得到400 mL香菇提取液。

1.3.2 樣品中游離態揮發性組分的前處理

取8 mL香菇提取液置于20 mL頂空螺紋口樣品瓶中，再分別向其中加入2.0 g NaCl、磁力攪拌子，以20 μL仲辛酮（1.010 2 g/L）為內標制成游離態揮發性組分的待測樣品。兩種方法得到的香菇提取液各重復3次實驗，并直接用于GC-MS進行檢測。

1.3.3 樣品中鍵合態揮發性組分的前處理

利用索氏提取法提取活化安博萊特XAD-2大孔吸附樹脂，正戊烷、乙酸乙酯、甲醇依次回流處理30.0 g樹脂，每個溶劑回流處理12 h，然后將甲醇作為溶劑濕法裝柱。

首先用1 000 mL去離子水平衡樹脂，洗至無醇味；上350 mL香菇提取液樣品，控制流速為3 mL/min，待提取液距離樹脂上端3 cm時關閉層析柱開關，靜置過一夜，依次用500 mL去離子水、400 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）溶劑淋洗，除去水溶性的糖、酸、游離態揮發性化合物等；用450 mL甲醇對待測成分進行洗脫并旋蒸至近干（水浴溫度35 ℃）。

配制0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 5.2），將樣品少量多次的溶解在30 mL緩沖液中。為保證結果的準確性，降低殘存的游離態組分對結果的影響，因此用90 mL等體積比的二氯甲烷-正戊烷溶劑分3次進行萃取。取下層水相加入500 mg纖維二糖酶進行酶解，為保證酶的最佳活性，將樣品置于37 ℃恒溫箱中。酶解48 h后取8 mL溶解液置于20 mL頂空螺紋口樣品瓶中，再分別向其中加入2 g NaCl、磁力攪拌子，以20 μL仲辛酮（1.010 2 g/L）為內標制成鍵合態揮發性組分的待測樣品，重復3次，用于GC-MS檢測。

1.3.4 GC-MS 分析條件

基于前人的經驗及對Einthoven三角定律的深入解讀[2-4]，我們嘗試尋找一種不用記憶大量錯接后心電圖形特點規律，僅畫圖就能快速準確地判斷出心電圖的各類導聯錯接的方法，還原“犯罪現場”。

HS-SPME：50 ℃平衡30 min，50 ℃萃取80 min，解吸5 min。

GC條件：J&W HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；分流進樣，分流比5∶1。程序升溫：起始溫度60 ℃，以10 ℃/min升至110 ℃；以15 ℃/min升至140 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升至180 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升至280 ℃。

MS條件：離子源溫度230 ℃；電子電離（electron ionization，EI）源模式；電子能量70 eV；質量掃描范圍45～550 u；掃描方式：全掃描；調諧文件為標準調諧。

1.3.5 定性定量分析方法

利用GC-MS分析檢測，借助C6～C20正構烷烴的保留時間計算色譜峰的保留指數（retention index，RI），參照美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）08數據庫對譜圖進行初步檢索及質譜分析，比對文獻報道的保留指數，對各個色譜峰輔助定性。

以20 μL仲辛酮的乙醇溶液（1.010 2 g/L）為內標物，采用內標法定量。根據式（1）計算揮發性成分的含量[16]。

式中：xi表示組分含量，μg/L；ms表示內標化合物質量濃度，μg/L；Ai表示化合物的峰面積；As表示內標物峰面積；fi表示待測組分對內標物的質量校正因子（量綱為1）。

2 結果與分析

采用HS-SPME富集不同方法提取的干香菇菌蓋中揮發性成分，利用GC-MS對化合物進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，利用煎煮法得到的香菇提取液中游離態揮發性成分有41種，鍵合態揮發性成分有19種；利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中游離態揮發性成分有42種，鍵合態揮發性成分有19種。

圖1 煎煮法（A、B）及水蒸氣蒸餾法（C、D）得到香菇提取液中揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in Lentinus edodes extract by decocting method (A,B) and steam distillation method (C,D) analyzed by GC-MS

由于流動相的極性大于固定相的極性，且根據圖1，對于游離態揮發性成分來說，保留時間較短的時候峰個數比較多，說明游離態揮發性成分中含極性較大的物質種類比較多；對于鍵合態揮發性成分來說，保留時間較長的時候峰個數比較多，說明鍵合態揮發性成分中含極性較小的物質種類比較多。

以內標法進行定量分析，解析干香菇菌蓋中揮發性成分的具體物質及含量，結果如表1所示。

表1 干香菇揮發性成分分析結果Table 1 Analysis results of volatile components in dried Lentinus edodes

續表

續表

根據表1可得，兩種方法提取的干香菇中共同的游離態揮發性成分23種，共同的鍵合態揮發性成分14種。利用煎煮法得到的香菇提取液中，含有烴類（15種）、芳香類（6種）、醇類（6種）、酯類（12種）、醛類（4種）、酮類（9種）、含硫化合物（4種）等化合物，其中含硫化合物的含量最多；利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中，烴類（11種）、芳香類（6種）、醇類（9種）、酯類（8種）、醛類（6種）、酮類（13種）、含硫化合物（4種）、呋喃（1種）等化合物，其中含硫化合物的含量最多。兩種方法都是游離態的種類及含量多于鍵合態，利用兩種方法得到的香菇提取液的揮發性成分有所差異，利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中檢測到呋喃，而利用煎煮法得到的香菇提取液中未檢測到。

雖然香菇中含有眾多揮發性化合物，但起主要作用有兩類：以醇為主的八碳化合物和含硫化合物[17]。在脂肪氧化酶催化亞油酸時會產生有特征蘑菇風味的八碳化合物[18]，其中最為突出的成分是1-辛烯-3-醇，在鮮香菇中有著特殊的地位，干香菇中亦可檢測到，但其含量低于鮮香菇。如表1所示，兩種不同方法處理的香菇的游離態中都可檢測到1-辛烯-3-醇，在利用煎煮法得到的香菇提取液的游離態中含量為4.05%，在利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液的游離態中含量為0.20%。含硫化合物是主要影響干香菇的風味的物質，如表1中二甲基二硫醚、1,2,3,5,6-五硫環庚烷等。香菇酸作為香菇中的前體化合物，在補谷氨酸基轉膚酶和半朧氨酸亞礬裂解酶的催化下，經過二硫環丙烷中間體聚合成1,2,3,5,6-五硫環庚烷（香菇精）[19]。香菇精的熱穩定性較差，容易受溫度的影響，在其形成的過程中伴隨著二甲基二硫醚等含硫化合物的產生[20]。

如表1所示，通過煎煮法、水蒸氣蒸餾法處理的干香菇菌蓋的游離態、鍵合態中，含硫化合物的含量分別為957 353.11 μg/L、0、960 704.71 μg/L、426 340.10 μg/L。不同處理方法影響香菇揮發性成分，劉璐等[21]研究發現，利用蒸汽漂燙、沸水漂燙處理鮮香菇大大影響了香菇中含硫化合物的相對含量，蒸汽燙漂鮮香菇，含硫化合物相對含量增至87.64%；香菇經沸水燙漂，含硫化合物降為2.85%。本實驗采用煎煮的方式處理干香菇，得到的香菇提取液的含硫化合物含量為40.3%，經水蒸氣蒸餾得到的香菇提取液中含硫化合物的相對含量為39.5%。楊肖等[22]用不同方法處理香菇，用SPME-GC-MS技術檢測不同狀態香菇中的揮發性成分，總共檢測到72種揮發性成分。本實驗采用兩種不同方法處理干香菇，利用HS-SPME-GC-MS檢測分析，在干香菇菌蓋中得到79種揮發性成分。安晶晶等[23]采用SDE-GC-MS技術，從鮮香菇和干香菇兩種不同狀態的香菇出發，對其風味成分進行了對比。本實驗以干香菇為研究對象，研究了影響其風味物質的化合物含量，將鮮香菇加熱干燥制成干香菇的過程中，八碳化合物氧化分解，含量越來越少，相反，含硫化合物的含量增多，成為干香菇的重要風味物質。李文等[24]分析香菇不同階段特征性揮發性成分，在其6個生長階段中，總共檢測到134種起重要作用的揮發性化合物。本實驗分別采用煎煮法、水蒸氣蒸餾法提取干香菇菌蓋中揮發性成分，利用HS-SPME-GC-MS對揮發性成分進行富集、檢測，不同方法處理的香菇得到的揮發性成分的含量和種類有所不同。香菇的揮發性成分種類繁多，正是由含硫化合物、以醇類為主的八碳化合物、醚類等物質共同作用影響了香菇特殊的風味[25]。

3 結論

通過采用HS-SPME-GC-MS對煎煮法、水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液進行富集、檢測分析，分別檢測其游離態揮發性成分和鍵合態揮發性成分。利用煎煮法得到的香菇提取液的游離態揮發物41種，鍵合態揮發物19種；利用水蒸氣蒸餾法得到的游離態揮發物42種，鍵合態揮發物19種。分別利用煎煮法、水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液，揮發性成分的數量相近，但是在含量、種類上有所差異。相較于煎煮法，水蒸氣蒸餾法處理的香菇風味更濃郁，主要是因為香菇提取液中揮發性成分的含量更高，尤其是決定干香菇特殊風味物質的含硫揮發性化合物的含量更高，如二甲基二硫醚、1,2,3,5,6-五硫環庚烷等，因此在對干香菇進行精深加工時采用水蒸氣蒸餾法保證了香菇類產品濃郁的獨有風味。不僅滿足了大眾對香菇風味的需求，還為香菇的發展帶來經濟效益。經過HS-SPME吸附萃取，與GC-MS檢測分析，簡單快速、高靈敏度、高效的檢測到干香菇中揮發性組分，為開發香菇的風味物質產品提供方法學的支撐。