美沙西汀-甲氧基-13C的合成工藝研究*

陳 凱，卿 晶，代德勝，王春玲，魏翠雯，沈桂富

(深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東 深圳 518057)

呼氣試驗是指通過測定呼氣成分呼氣中的標志氣體，實現對身體狀態的非侵入性診斷。呼氣試驗操作簡單、容易被受檢者接收，研究非?；钴S[1]。目前多項呼氣試驗技術已經應用于臨床診斷，如13C-螺旋藻診斷胃排空功能障礙[2]、13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染[3-4]和一氧化氮呼氣檢測哮喘[5]。其中13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染在臨床應用中頗受歡迎，已經成為呼吸內科臨床診斷幽門螺桿菌感染的主流方案。

肝臟擔負著多種重要的生化功能，是人體最重要的代謝器官之一，肝功能準確性測定有重要的臨床意義。目前常用的檢測方法包括藥物動力學試驗、血液生化檢查等。鑒于13/14C-尿素呼氣試驗在市場推廣中取得了巨大的成功，13C-標記化合物呼氣試驗檢測肝功能成為一個新的研究熱點。在目前報道研究中，科研工作者試驗了多種標記化合物，例如：美沙西汀-甲氧基-13C[6-7]、13C-氨基比林[8]、L-[1-13C]-苯丙氨酸[9]等，其中美沙西汀-甲氧基-13C較其他的標記化合物具有用量小、代謝快、適用性廣等優點，是研究最活躍的肝功能呼氣試驗底物。鑒于美沙西汀-甲氧基-13C呼氣試驗的特點，近些年關于美沙西汀-甲氧基-13C檢測肝功能的臨床實驗和研究論文日趨增多，多項臨床實驗處于臨床Ⅱ期和臨床Ⅲ期。

本研究旨在研究以甲醇-13C為標記試劑合成美沙西汀-甲氧基-13C的工藝路線參數。本文以Williamson反應作為關鍵反應，配合簡單的官能團轉化高效合成了美沙西汀-甲氧基-13C。該合成路線標記產物純度高，同位素標記試劑甲醇-13C利用率高，是一種合成美沙西汀-甲氧基-13C的工藝化方案。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

儀器：XPE303S型電子天平,梅特勒-托利多；MS7-H550-Pro數顯加熱磁力攪拌器,大龍興創實驗儀器股份公司；機械攪拌,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；SHK-Ⅲ循環水式多用真空泵,鄭州科泰實驗設備有限公司；EYELA東京理化旋轉蒸發儀N-1300系列,東京理化器械株式會社；HB-20耐腐蝕隔膜真空泵,上海滬析實業有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司；核磁共振氫譜,布魯克400 M核磁AVANCE-Ⅲ；檢測和高分辨質譜,賽默飛高分辨質譜Q Exactive Focus。

試劑：對乙酰氨基酚(純度>98%),碳酸鉀(純度>98%)，薩恩化學技術(上海)有限公司；甲醇-13C(純度>98%，同位素豐度為99atom%13C)、美沙西汀-甲氧基-13C(純度98.7%，同位素豐度為99atom%13C),劍橋同位素實驗室;所有溶劑均為市售化學純或分析純試劑，不經處理直接使用。

1.2 試驗步驟

將紅磷(50 g，1.61 mol)、水(100 mL)投入到帶回流裝置的反應器中，冷卻至-15 ℃，緩慢加入碘(250 g，1 mol)。在-15 ℃條件下緩慢加入甲醇-13C(40.5 mL，1 mol)，將反應體系升溫至回流，反應2 h。冷卻反應體系，將反應裝置更換為蒸餾裝置，收集45 ℃左右的冷凝液。

將對乙酰氨基酚(151.0 g，1 mol)溶解于1 L乙腈中，加入碳酸鉀(276 g，2 mol)，用機械攪拌攪拌60 min，將上一步驟蒸餾得到的產物緩慢加入反應體系，在35 ℃攪拌12 h。靜置反應液，過濾，用乙腈洗滌濾餅。收集濾液后，向濾液中加入100 mL氫氧化鈉水溶液(含量為10%)，攪拌10 min后分液。濾液旋干后得到的固體在75 ℃用乙醇溶解，體系恢復室溫后用在2～8 ℃放置6 h，過濾得到白色晶體，烘干后稱重，計算收率。

1.3 產物表征

產物美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜如下：1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.02 (s, 1H), 7.60～7.45 (m, 2H), 6.92～6.75 (m, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.03 (s, 3H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質譜數據為ESI-MS: [M+H]+=167.0896，[M+Na]+=189.0716。合成樣品的核磁共振氫譜和高分辨質譜均與劍橋同位素實驗室購買的對照品一致。核磁共振氫譜顯示由于碳13的自旋量子數為1/2，美沙西汀-甲氧基-13C中甲氧基上的三個峰被裂分為d峰。

圖1 美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.1 1H-NMR of methacetin-methoxy-13C

本文以從劍橋同位素實驗室的美沙西汀-甲氧基-13C樣品(含量為98.7%)作為對照品。通過分析對照品和合成樣品的高效液相數據，推算出合成樣品的含量為99.3%。經高分辨質譜檢測美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的同位素豐度為99.2atom%13C，相對于標記原料豐度未發生明顯降低。

2 結果與討論

2.1 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線

圖2 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線Fig.2 Synthetic route of methacetin-methoxy-13C

美沙西汀-甲氧基-13C合成最大的難點是如何活化甲醇-13C中的碳氧鍵，文獻調研顯示可首先將甲醇-13C中的碳氧鍵轉化為碳鹵鍵，然后利用Williamson反應合成美沙西汀-甲氧基-13C。Williamson合成醚鍵時伯鹵代烷是效果最佳反應底物，對于一般的烷基醇，反應需要使用強堿，比如NaH、LDA等，而對于酸性較強的酚羥基，使用碳酸鉀或者碳酸銫即可。第一步甲醇羥基碘化反應，可使用碘化鉀、磷酸將甲醇-13C中的羥基碘化，該方法雖條件溫和，但收率不高。因此本文嘗試使用紅磷、碘將甲醇-13C中的羥基碘化，該方法在操作的時候控制好溫度和加料速度，可得到較高收率。接下來本文重點篩選了Williamson的反應條件。

2.2 Williamson反應溶劑的篩選

本文篩選了Williamson反應的反應溶劑。從表一(反應規模為10 mmol，收率以甲醇-13C作為起始物計算)可以發現丙酮和乙腈作為溶劑時反應效果更好，反應總體收率較高(氮氮二甲基甲酰胺也是一種效果好反應溶劑，但由于該溶劑沸點高，最后完全去除的難度較大不利于產物的純化，本實驗沒有進行嘗試)，常用的乙酸乙酯和二氯甲烷作為溶劑時收率低。丙酮和乙腈的效果均較好，但考慮到丙酮為管制試劑，實驗溶劑本文選用了乙腈。

表1 溶劑對反應收率的影響Table 1 Effect of solvent on reaction yield

2.3 Williamson反應溫度的篩選

確定了Williamson反應的溶劑之后，本文考察了溫度對于合成反應的影響?？紤]到碘甲烷的沸點僅有42.5 ℃，溫度過高會加速碘甲烷揮發，降低反應收率，因此本實驗設定的4個反應溫度分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。結果表明反應溫度對收率影響較小，對反應時間影響較大。在20 ℃時，反應完全結束需要48 h，而35 ℃時僅需要5 h，可以大大提高效率(反應規模為10 mmol，收率以甲醇-13C作為起始物計算)。

表2 反應溫度的篩選Table 2 Screening of reaction temperature

2.4 Williamson反應濃度的篩選

隨后本文進行了反應規模放大研究。當反應的量從10 mmol增加到100 mmol時，反應時間從5 h增加到21 h，為了縮短反應時間，本文嘗試增加反應液的濃度，實驗表明反應時間隨著濃度的增大而縮短?？紤]到反應體系中含有大量的固體碳酸鉀，最終的反應濃度定位1 mol/L。

表3 反應液濃度的篩選Table 3 Screening of reaction solution concentration

2.5 中試工藝及結果

通過Williamson合成方案實驗條件的篩選，本文優化好的條件為：碳酸鉀做堿；乙腈作反應溶劑；反應溫度為35 ℃；反應液濃度為1 mol/L。隨后本文進行了放大試驗研究，將反應規模放大至1 mol。在產物的純化過程中，本文使用堿液攪拌分離掉沒有參與反應的對乙酰氨基酚，之后在乙醇溶劑中重結晶即可得到美沙西汀結晶品。在放大反應的操作中，每次實驗合成階段的時間約為20 h，后處理與純化操作的時間約為30 h。

表4 美沙西汀-甲氧基-13C的工藝放大路線及收率Table 4 Process route and yield of methacetin-methoxy-13C

3 結 論

通過對溶劑、溫度和濃度等關鍵實驗參數的研究，確定了最優的合成工藝參數，解決了百克級合成美沙西汀-甲氧基-13C的難題。在百克級的合成中，以甲醇-13C為標記原料的總收率在65%左右，產品美沙西汀-甲氧基-13C純度在99%左右。美沙西汀-甲氧基-13C的同位素豐度相對于標記原料甲醇-13C未發生明顯降低。美沙西汀-甲氧基-13C的合成為進一步的呼氣試驗研究提供了基礎。