木薯枯草桿菌蛋白酶家族鑒定及MeSDD1的功能分析

肖 亮 鮑茹雪 曹 升 陸柳英 尚小紅 曾文丹聶宣紅 嚴華兵,2,*

(1 廣西壯族自治區農業科學院經濟作物研究所，廣西 南寧 530007；2 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530007；3 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101；4 越南農業科學院， 河內 12500 越南)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是三大薯類作物之一，全球第六大糧食作物，用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業產品，如淀粉、酒精等[1]。隨著全球氣候變暖，干旱已經成為影響農作物產量的主要環境因子之一[2]。近十年來由于干旱造成的農作物減產損失已達到約300億美元[3]。在木薯主產區廣西，木薯主要種植在旱坡地上，主要土壤類型為磚紅壤和赤紅壤，土壤條件干旱、貧瘠，干旱是制約木薯產量的重要因素之一[4-5]。因此增強木薯耐旱性具有重要的生物學及經濟學意義。

SBT基因家族是一類龐大的家族，例如其在小立碗蘚(Physcomitrellapatens)基因組中有23個成員，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有56個成員[6-7]，在水稻(Oryzasativa)中有63個成員[8]，在楊樹(Populustrichocarpa)中有90個成員[9]，在葡萄(Vitisvinifera)中有80個成員[9]，在番茄(Solanumlycopersicum)中有15個成員[10]。大量研究表明枯草桿菌蛋白酶(subtilase, SBT)參與植物非生物脅迫反應。擬南芥基因組中SBT基因SDD1(stomataldensityanddistribution1)通過影響氣孔密度調節擬南芥植株的抗旱性[11]，后續研究結果表明該基因在氣孔前體細胞中高表達，并通過產生信號物配體，激活細胞膜上的激酶蛋白，進而控制細胞線性發育并導致保衛細胞形成[12-13]。研究表明，板藍根(Isatisindigotica)的IiSDD1受干旱和脫落酸處理后下調表達[14]。在玉米(Zeamay)中過表達ZmSDD1后轉基因植株的氣孔數目下降30%，干旱脅迫后過表達ZmSDD1植株存活率相比于野生型大幅度提高[15]。前期研究表明，干旱脅迫條件下，18個木薯SBT基因下調表達[16]，但木薯MeSDD1能否增強植株的抗旱性仍有待研究。

鑒于此，本研究通過生物信息學方法鑒定木薯全基因組中SBT成員，明確其在染色體上的分布，分析各成員的基本結構特點；從木薯基因組中分離與擬南芥SDD1高度同源的基因MeSDD1，研究其抗旱功能，以期為木薯抗旱遺傳改良提供理論基礎和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯(ManihotesculentaCrantz)品種為新選048，擬南芥(Arabidopsisthaliana)材料為Col生態型；菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，植物表達載體為pC2 300s-GFP，均由廣西壯族自治區農業科學院木薯課題組保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 木薯SBT家族成員的鑒定、系統進化樹的構建及各成員的染色體分布分析 利用Phytozome12(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)結合NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫通過Blast分析，獲得所有木薯SBT家族成員的編碼區(coding sequence, CDS)、氨基酸、轉錄本和基因組序列。使用MEGA 5.0軟件，將獲得的木薯SBT家族成員與56個擬南芥SBT成員構建進化樹，并于在線工具EVOLVIEM(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)中對進化樹進行編輯。利用MapInspect軟件(http://www.plantbreeding.wur.nl/UK/software_mapinspect.html)對木薯SBT家族成員進行染色體定位分析。

1.2.2 木薯SBT家族成員基因結構及保守基序分析 結合進化樹，使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析所有成員的基因結構，并使用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)分析保守模體。

1.2.3 木薯SBT基因家族啟動子元件分析 提取所有木薯SBT家族成員基因組序列起始密碼子ATG上游2 000 bp序列作為木薯SBT家族基因的啟動子，利用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)分析啟動子區域的順式作用元件種類。

1.2.4MeSDD1基因克隆與植物表達載體的構建 使用植物RNA提取試劑盒(寶生物工程大連有限公司)提取正常生長2個月的木薯新選048葉片組織總RNA，用反轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)逆轉錄合成cDNA，依據Manes.18G044300的編碼區序列設計PCR引物19OV104，引物序列見表1。PCR體系50 μL：DNA 1 μL, 10×Buffer 5 μL, dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL, 19OV104-F(10 μmol·L-1)1 μL, 19OV104-R(10 μmol·L-1)1 μL, TAQ(1 U·μL-1)1 μL, ddH2O 40 μL。反應程序如下：94℃預變性5 min；98℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環32次；68℃終延伸5 min。25℃保存。利用瓊脂糖回收試劑盒(寶生物工程大連有限公司)切膠回收PCR產物并純化，采用TA克隆，挑選3個單克隆送交上海生工測序驗證。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

用SacI與BamHI雙酶切處理pC2300s-GFP(35S啟動子)表達載體獲得線性化載體，將同樣純化的目的片段MeSDD1與線性化pC2300s-GFP載體用T4連接酶連接形成重組質粒19ATK50。

1.2.5 擬南芥遺傳轉化及陽性植株篩選鑒定 在營養土中點播擬南芥種子，22±2℃培養至開花期備用；采用電轉化法將重組質粒19ATK50轉化到根癌農桿菌GV3101感受態、挑選陽性單克隆、菌落PCR鑒定后，將其接種在含有利福平和卡那霉素的LB液體培養基上，28℃振蕩培養至OD600值在0.4～0.6之間。

采用蘸花法浸染擬南芥花序，使花浸入菌液中60 s，1周后再次轉化，浸染后的植株在22℃、12 h光照/12 h黑暗的培養間培養至收獲種子(T0代)。利用次氯酸鈉對種子消毒后，接種于含50 mg·L-1卡那霉素的MS培養基中，22℃培養1周后，挑選正常萌發的陽性植株移栽到含泥炭土、蛭石(體積比為1∶3)的營養缽中，培養管理至收種獲得T1代。利用法抽提10株T1代植株葉片基因組DNA，利用NPTII特異引物進行PCR檢測。每個株系單獨收種子獲得T2代，將T2代種子播種在卡那霉素抗性培養基上，培養7～10 d，用鑷子選取生長正常的綠苗，用水輕洗以洗掉根上的培養基，移栽到營養缽后澆定根水，成活苗用于下一步研究。

1.2.6 實時熒光定量PCR表達檢測 取轉基因T2代陽性植株和野生型植株幼嫩葉片，用Trizol試劑盒(寶生物工程大連有限公司)提取RNA，反轉錄獲得cDNA，利用Primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在線設計MeSDD1的實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物QP，引物序列見表1，以擬南芥基因AtACTIN(At3g18780)為內參基因，采用qRT-PCR技術檢測MeSDD1在野生型和轉基因株系中的相對表達水平，表達水平以2-ΔΔCt方法計算。

1.2.7 轉基因植株的抗旱性分析 以野生型和2個轉基因株系OE-1和OE-2為材料，檢測葉片相對含水量、離體葉片失水率和氣孔密度，并進行抗旱性鑒定。取擬南芥蓮座葉，稱量重量記為W，放入水中6 h后稱重記為Wt，然后烘干至一個恒定的重量，記為Wd，每個基因型設置3個重復。相對含水量=(W-Wd)/(Wt-Wd)×100%。

取擬南芥蓮座葉，將離體葉片置于濾紙上，葉背面朝上，每個基因型設置3個重復，在光周期為16 h光照/8 h黑暗的條件下培養。每隔1 h稱取葉片的重量，初始葉片重量記為M0，每個時間點測得的葉片重量記為Mn(n=1～8)。失水率=(M0-Mn)/M0×100%。

取野生型和2個轉基因擬南芥植株倒數第3片葉進行氣孔密度的檢測，具體方法參考文獻[17]。每個樣品至少拍10個不同的視野后進行統計。

將野生型和轉基因擬南芥播種在營養缽中后放入穴盤，統一管理，15 d后開始斷水處理，斷水14 d后觀察植株表型。

1.3 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel 2010和SPSS 11.5軟件進行整理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 木薯SBT家族成員的鑒定及系統進化樹的構建

利用Phytozome12(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)結合NCBI數據庫通過Blast獲得69個木薯SBT家族成員的CDS、氨基酸、轉錄本和基因組序列。利用MEGA5.0對56個擬南芥枯草桿菌蛋白酶和69個木薯SBT家族成員的氨基酸構建進化樹。根據同源性分析，可以將木薯SBT家族成員分成五大類(I～V)，I類為Manes.01G070400、Manes.01G070500、Manes.01G070600、Manes.01G167600、Manes.02G028900、Manes.06G020400、Manes.07G122300、Manes.10G021800、Manes.18G039300等9個，Ⅱ類為Manes.01G267200、Manes.05G175300、Manes.06G139800、Manes.16G104900等4個，Ⅲ類為Manes.02G030800、Manes.03G066700、Manes.08G023600、Manes.16G063100等4個，Ⅳ類為Manes.01G088700、Manes.01G158500、Manes.04G005200、Manes.04G146100、Manes.04G153100、Manes.05G041400、Manes.05G175400、Manes.06G013400、Manes.09G057300、Manes.09G072100、Manes.10G021400、Manes.10G021500、Manes.10G021600、Manes.10G021700、Manes.10G079600、Manes.11G010100、Manes.11G010200、Manes.12G067800、Manes.12G081800、Manes.13G059200、Manes.13G123200、Manes.14G157400、Manes.16G106100、Manes.18G039200、Manes.18G044300、Manes.17G027600等26個，V為Manes.01G069100、Manes.01G069200、Manes.01G167700、Manes.01G222700、Manes.02G029000、Manes02G011100、Manes.03G086500、Manes.04G074500、Manes.04G150200、Manes.04G153200、Manes.05G206600、Manes.05G206800、Manes.06G013200、Manes.06G013300、Manes.11G013600、Manes.11G018900、Manes.12G038100、Manes.13G039400、Manes.13G113900、Manes.14G164700、Manes.16G063000、Manes.16G094900、Manes.17G062600、Manes.18G010600、Manes.18G039000、Manes.S08900等26個。其中Manes.18G044300和擬南芥AtSDD1(AT1G04110.1)親緣關系較近(圖1)。因此，該基因被命名為MeSDD1。

注：紅色箭頭示木薯MeSDD1，綠色箭頭示擬南芥SDD1。Note: The red arrow represented MeSDD1, the green arrow represented AtSDD1.圖1 擬南芥和木薯SBT家族成員系統進化樹分析Fig.1 Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana and cassava SBT family member

2.2 木薯SBT家族成員的染色體分布

基因組染色體定位結果表明，除了第15號染色體，木薯SBT家族成員在其他17條染色體上均有分布。第1號染色體分布最為密集，有12個SBT成員，Manes.S08900位于染色體末端；第2、第11和第13號染色體均有4個SBT成員；第3、第9和第17號染色體均只有2個SBT成員；第4和第10號染色體分別分布了6個SBT成員；第5、第6、第16和第18號染色體均有5個SBT成員；第7和第8號染色體均只有1個SBT成員；第12號染色體有3個SBT成員；第14號染色體有2個SBT成員(圖2)。

注：左邊的數字表示該染色體的大小，標尺為Mb。Note: Left numbers represented size of the chromosome, scale is Mb.圖2 木薯SBT基因家族的染色體分布Fig.2 The chromosomal location of SBT members in cassava

進一步分析表明，多數成員在染色體上呈緊密串聯分布，第1號染色體有5個SBT成員(Manes.01G069100～Manes.01G069200; Manes.01G070400～Manes.01G070600)呈串聯分布，第10號染色體有5個SBT成員(Manes.10G021400～Manes.10G021800)呈簇排列，第2、第4、第5、第6、第11、第16、第18號染色體均有2個成員緊密串聯，分別是Manes.02G28900和Manes.02G29000；Manes.04G153100和Manes.04G153200；Manes.05G175300和Manes.05G175400；Manes.06G013200和Manes.06G013300；Manes.11G010100和Manes.010200；Manes.16G063000和Manes.16G063100；Manes.18G039200和Manes.18G039300(圖2)。

2.3 木薯SBT家族成員基因結構和保守域分析

為了更好地了解木薯SBT家族基因的結構特征，依據進化樹(圖3-A)對外顯子和內含子結構進行了分析，結果表明，Manes.18G044300(MeSDD1)等22個成員沒有內含子，6個成員只有1個內含子，2個成員有2個內含子，2個成員有3個內含子，Manes.063000和Manes.029000分別有4個內含子和5個內含子，4個成員含有7個內含子，7個成員含有8個內含子，13個成員含有9個內含子，11個成員含有10個內含子。多數外顯子數目相似成員聚為一類(圖3-B)。

注: A: 進化樹分析; B: 基因結構分析; C: 保守模體分析。Note: A: Evolutional tree analysis. B: Gene structure analysis. C: Conserved motif analysis.圖3 木薯SBT家族基因結構和保守域分析Fig.3 Cassava SBT genes structural distribution and conserved protein motifs

木薯SBT家族成員共含有10個模體，其中保守結構域為模體1、模體2、模體4、模體5和模體7。Manes.04G153100只含有模體1，Manes.16G063100和Manes.02G011100只含有模體7；5個保守結構域基本均勻分布于57個SBT成員中(圖3-C)。保守域基序的序列如圖4所示。

圖4 木薯SBT家族蛋白質的10個模體基序的Logo展示Fig.4 Logo display of the ten conserved motifs of cassava SBT family proteins

2.4 木薯SBT基因家族啟動子元件分析

為了進一步了解該基因家族成員的功能，對啟動子上的順式作用元件進行了預測分析。結果表明，該基因家族成員含有光反應Box和多種激素類響應元件如ABRE(脫落酸響應元件，TACGTG)、AuxRR-core(生長素響應元件，GGTCCAT)、轉錄因子GT1的結合位點(GGTTAA/TTAACC)、P-box(赤霉素響應元件，CCTTTTG)、MBS(干旱誘導響應元件，CAACTG)、MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，V-myb禽成髓細胞病病毒癌基因同源物)轉錄因子結合位點(CAACCA)和MYC[vmyc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)，V-myc髓細胞組織增生病毒癌基因同源物(鳥類)]轉錄因子結合位點(CAATTG)(表2)。

表2 SBT家族基因啟動子順式作用元件及功能Table 2 Function and cis-acting elements existed in promoters of the SBT family genes

2.5 MeSDD1基因的克隆

MeSDD1基因的PCR擴增結果如圖5中箭頭所示，測序結果表明，該基因CDS全長為2 316 bp，編碼771個氨基酸。序列比對結果表明，MeSDD1與Manes.18G044300相似性為100%。

注: 左: DL2000 DNA分子量標準; 右: MeSDD1的cDNA擴增片段。Note: Left: DL 2000 marker. Right: cDNA amplification of MeSDD1.圖5 木薯MeSDD1的cDNA擴增Fig.5 cDNA amplification of MeSDD1 in cassava

2.6 轉基因擬南芥陽性植株篩選鑒定

將pC2300S-MeSDD1通過遺傳轉化獲得10個獨立的T1代轉基因材料，利用NPTII特異引物進行PCR檢測，表明10個轉基因株系均為陽性(圖6)。每個株系單獨收種子獲得T2代，經過卡那霉素抗性培養基篩選，隨機挑選2個獨立的轉基因株系OE-1和OE-2進行qRT-PCR檢測。結果顯示，2個株系MeSDD1的表達量均顯著高于野生型(wildtype，WT)(圖7)。

注: M: DL2000 DNA分子量標準; B: 空白對照; N: 陰性對照; P: 陽性對照; 1～10: MeSDD1轉基因株系。19ATK50: 目的片段與表達載體形成的重組質粒。Note: M: DL 2000 marker. B: Blank control. N: Negative control. P: Positive control. 1～10: MeSDD1 transgenic lines. 19ATK50: The recombinant plasmid composed of the target fragment and the expression vector.圖6 轉基因擬南芥T1代陽性株系的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of positive T1 generation transgenic Arabidopsis thaliana lines

注: 不同小寫字母表示在P<0.05水平有顯著性差異。下同。Note: Different lowercase letters represent significant different at 0.05 level. The same as following.圖7 轉基因株系中MeSDD1的表達量Fig.7 Transcript level of MeSDD1 in transgenic lines

2.7 轉基因擬南芥的抗旱生理指標鑒定

由圖8可知，轉基因株系的葉片相對含水量顯著大于野生型(圖8-A)。轉基因株系的葉片失水率小于野生型(圖8-B)。轉基因株系的氣孔密度顯著低于野生型(圖8-C)。

注: A: 野生型和轉基因株系的相對含水量; B: 離體葉片失水率; C: 氣孔密度。Note: A: The relative water content of wide type and transgenic lines. B: Water loss percentage of detached leaves. C: Stomatal density.圖8 轉基因擬南芥的抗旱生理指標鑒定Fig.8 Characteristics of physiology index of drought resistance of transgenic Arabidopsis plants

2.8 轉基因擬南芥的抗旱表型鑒定

野生型和轉基因植株有表型差異，野生型植株生長弱小，蓮座葉幾乎萎焉且接近死亡，只能觀察到少數花；轉基因植株生長高大旺盛，蓮座葉葉片生長旺盛，植株開花數量明顯比野生型多(圖9)。

圖9 轉基因擬南芥植株的抗旱性鑒定Fig.9 Identification of drought resistance of transgenic Arabidopsis plants

3 討論

SBT家族是一類龐大的基因家族，植物SBT家族基因不僅參與葉片氣孔形成，還參與果實成熟[18]、種子發育[19]、細胞程序性死亡[20]、植物與病原菌互作[21]。本研究從木薯基因組中鑒定到69個SBT成員，親緣關系相近的成員有相似的內含子-外顯子結構，接近1/3的成員沒有內含子，這種差異可能是SBT基因在進化過程中內含子的獲得率與丟失率的差異導致的[22]。擬南芥與番茄中SBT基因同樣有大部分成員無內含子[10]。內含子的獲得與丟失與基因的進化率相關[22]。例如，一些幾乎不含內含子的基因(F-box基因家族、早期生長素響應SAUR、DEAD box RNA解旋酶)通常在進化中經歷正向選擇[23]。由于內含子處于不斷獲得與丟失的過程中，在一些基因家族中的分布不會完全一樣[24]。木薯SBT基因家族是否具有類似的效應還需要進一步研究。

木薯SBT家族基因在染色體上呈緊密串聯分布，如第10號染色體有5個SBT成員呈簇排列，結合這些成員的基因結構，表明基因重復在SBT家族基因擴張過程中發揮了重要作用，且在 SBT 家族基因擴張過程中，伴隨了基因的亞功能化、新功能化及表達模式的改變。

在干旱脅迫條件下，植物為了減少水分散失，減少氣孔數量是最有效的途徑之一[17,25]。氣孔發育過程涉及一系列細胞分裂和連續的細胞狀態轉變。首先，原皮細胞分化為分生組織母細胞，經歷不對稱分裂產生一個小的三角形細胞和一個大的姊妹細胞(氣孔線性細胞)。然后氣孔線性細胞分化成葉狀密生細胞。最后，分生組織轉變成圓形保衛母細胞，單個保衛母細胞對稱分裂生成一對保衛細胞，形成氣孔[26-27]。該過程受到多個關鍵基因的調節[28]，其中SDD1作為重要的蛋白酶，通過催化底物形成信號物激活下游MAPK信號通路抑制下游3個負責保衛細胞分化bHLH轉錄因子的轉錄控制細胞線性發育[12,29]。本研究結果表明，相對于野生型，35S啟動子驅動的MeSDD1過表達擬南芥植株葉片細胞產生了更多的信號物，導致氣孔發育相關基因表達豐度增加，導致分化出的保衛細胞數量更少，進而引起氣孔密度降低；MeSDD1轉基因植株相對含水量較野生型顯著增加，每個時間點的葉片失水率均小于野生型。綜上所述，MeSDD1轉基因植株通過減少氣孔密度減少水分散失增強了其對干旱脅迫的抗性。

4 結論

本研究利用生物信息學方法，在木薯全基因組水平鑒定到69個SBT成員，其中22個成員無內含子，69個成員的蛋白均攜帶5個高度保守的結構域，一些SBT成員在染色體上呈緊密的串聯分布，啟動子存在干旱響應元件和植物生長發育有關的順式調控元件，其中Manes.18G044300(MeSDD1)與已報道的擬南芥SDD1基因親緣關系最近，且在擬南芥中過表達MeSDD1，可以增強植株的抗旱性。