煙草NtMYB4a基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及互作蛋白的篩選

謝瑞瑩 曾露桂 姜超英 聶 瓊,,*

(1貴州大學煙草學院，貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 2貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；3貴州省煙草公司 貴州 貴陽 550081)

轉錄因子(transcription factor，TF)指能夠與真核基因的順式作用元件發生特異性相互作用，并對基因的轉錄有激活或抑制作用的DNA結合蛋白[1]。轉錄因子一般含有DNA結合結構域和轉錄激活結構域，前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因上游，后者可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動轉錄激活結構域所調節的基因進行轉錄[2]。MYB轉錄因子(MYB transcription factor)家族被認為是植物中最大的一類轉錄因子，廣泛參與植物次生代謝、細胞分化、細胞周期調控、激素和環境因子的應答等生物學過程[3]，在植物抗逆應答過程中起著關鍵的調控作用[4]。此外，MYB轉錄因子通常與其他蛋白相互作用形成轉錄復合體共同調控各種代謝、發育過程或抗逆反應[5-6]。

酵母雙雜交系統利用雜交基因激活報告基因的表達，從而探測蛋白之間的相互作用[7]。該技術靈敏度高、功能強大、適用范圍廣，現已被應用于多個研究領域。在植物抗逆機制研究中，利用酵母雙雜交系統從cDNA文庫中篩選到9類與四季秋海棠(Begoniasemperflorens)BsMYB62互作的蛋白、2個與木薯(ManihotesculentaCrantz)MeMYB2互作的蛋白，并推測BsMYB62與這9類蛋白相互作用響應低溫和高光脅迫[8]，MeMYB2與MeNPH3互作參與光信號調節、與MePetB互作參與氣孔調節[9]。

煙草(Nicotianatabacum)是重要的經濟作物，也是重要的模式作物。探討煙草轉錄因子響應非生物脅迫的調控機制，對培育煙草抗逆品種具有重要意義。本課題組前期克隆了NtMYB4a(MN178131)，該基因具有2個典型的MYB結構域和35個磷酸化位點，屬于R2R3 MYB轉錄因子亞家族，該基因參與煙草綠原酸、花青素的合成，對干旱、低溫和鹽脅迫等也有明顯的響應[10]。而NtMYB4a參與調控這些次生代謝的合成或響應抗逆反應的轉錄調控機制仍有待研究。因此，本研究擬構建NtMYB4a基因酵母雙雜交誘餌載體，從煙草cDNA文庫中篩選其互作蛋白并驗證，以期為進一步研究NtMYB4a參與響應非生物脅迫的分子調控機制提供依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗材料為貴州大學煙草學院煙草品質研究重點實驗室保存的自育煙草品系GDH88、煙草酵母雙雜交cDNA文庫、pGBKT7載體；AH109和DH5α感受態購自上海唯地生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、質粒提取試劑盒(DP112)、酵母質粒提取試劑盒(DP103)、RNAprep pure Plant Kit總RNA提取試劑盒(DP432)、反轉錄試劑盒 FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑(KR118)、熒光定量試劑盒Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(FP209)等購自天根生化科技(北京)有限公司；X-α-gal(10903ES71)、Axygen(AxyPrep DNA)凝膠回收試劑盒購自貴州明涵生物科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a的構建 利用基因合成技術通過引物合成、PCR的方法將基因序列融合并克隆入pGBKT7載體進行pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體的構建。利用Primer Primer5軟件設計目的基因的引物(表1)。

表1 目的基因合成相關引物Table 1 Objective gene synthesis related primers

全長第一輪PCR反應體系(50 μL)：DNA聚合酶(PV2)0.5 μL、5×PV2 Buffer 10 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、引物0.5 μL、ddH2O 38 μL。反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性25 s，62℃退火20 s，72℃延伸40 s，25個循環；72℃延伸1 min，4℃保存。

全長第二輪PCR反應體系(50 μL)：第一輪PCR產物0.3 μL，DNA聚合酶(PV2)0.5 μL、5×PV2 Buffer 10 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、引物1 0.5 μL、引物12 0.5 μL、ddH2O 37.2 μL。同上一步反應程序。

膠回收第二輪PCR產物，流程參照Axygen凝膠回收試劑盒說明書進行。

用雙酶切pGBKT7質粒的NdeI、BamHI酶切位點，并進行膠回收，流程參照Axygen凝膠回收試劑盒說明書進行。

重組連接反應體系：目的基因膠回收產物4 μL、pGBKT7質粒3.5 μL、重組酶2.5 μL；置于50℃水浴25 min，放置2～3 min使溫度降低至室溫。

大腸桿菌的轉化：從-80℃超低溫冰箱取出DH5α感受態后，置于冰上融化，約15 min，待感受態融化后用移液槍吸取10 μL重組連接產物加入其中，冰浴15 min后42℃熱激90 s，立即進行冰浴2 min，然后加入1 mL的LB液體培養基，置于37℃、220 r·min-1溫浴搖床培養1 h，之后將轉化產物涂布于LB固體平板上(含卡那抗性)，再放于37℃恒溫培養箱中倒置過夜培養。

從過夜培養后的平板上挑取單菌落于裝有1 mL LB液體培養基的無菌離心管中，培養8～12 h后用pGBKT7的通用引物(T7/3′BD)進行菌液PCR，然后利用凝膠電泳鑒定陽性克隆，隨機挑選4個陽性菌用5 mL LB液體培養基于37℃、200 r·min-1的搖床進行擴繁培養，然后抽提質粒進行測序。最后將測序得到的序列利用DNAMAN軟件進行比對，若顯示目的片段NtMYB4a成功插在正確的序列位置，則說明誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a構建成功。

1.2.2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體毒性和自激活性檢測 取3管100 μL AH109酵母感受態細胞于冰上融化，分別加入誘餌重組質粒和獵物空載質粒各5 μL，Carrier DNA 10 μL(95～100℃水浴5 min，重復1次)，PEG/LiAc 500 μL，并用移液槍輕柔的吸打混勻，30℃水浴30 min(中途后翻轉6～8次混勻)；將離心管置于42℃水浴15 min(中途翻轉6～8次混勻)，然后取出置于離心機5 000 r·min-1離心40 s，棄上清，用400 μL ddH2O重懸，5 000 r·min-1離心30 s后棄上清，最后用200 μL ddH2O重懸，之后涂布于DDO、DDO/X、TDO平板上觀察菌株生長情況，由此判定誘餌的毒性和自激活檢測。若pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體有一定的本底表達，可通過使用3′AT抑制劑抑制其自激活性。

1.2.3 酵母雙雜交文庫篩選及陽性克隆的鑒定 將SD/-Trp平板上長至直徑2～3 mm的重組誘餌載體轉化菌落接種于50 mL SD/-Trp的液體培養基中，在30℃、250 r·min-1的搖床中培養直至菌液OD600=0.8。將菌液1 000×g離心5 min后，去除上清，用5 mL SD/-Trp 液體培養基進行重懸，獲得誘餌菌液。將 1 mL cDNA文庫和5 mL誘餌菌液接種于45 mL 2×YPDA液體培養基，于30℃、50 r·min-1條件下培養20 h，鏡檢結合生長子的產生。培養結束后將雜交菌液 1 000×g 離心10 min，去除上清，用10 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌體。將菌液按每板200 μL涂布于150 mm TDO/X平板，倒置于30℃培養箱培養3～5 d。增大篩選壓力排除假陽性，將直徑大于2 mm的藍色菌落全部點種至QDO/A/X平板上培養，倒置于30℃培養箱培養3 d，觀察互作情況。挑選藍斑克隆接種于3 mL QDO液體培養基，抽提酵母質粒，操作方法參照天根酵母質粒提取試劑盒(DP112)進行，并送至上海生物工程有限公司測序。采用BLAST進行序列比對。

1.2.4 回轉酵母驗證 以獵物質粒載體PGADT7的通用引物進行PCR擴增鑒定。將AH109酵母感受態細胞置于冰上融化，向30 μL酵母感受態中分別加入誘餌質粒和獵物質粒各5 μL，Carrier DNA 10 μL(95～100℃水浴5 min，重復1次)和500 μL PEG/LiAc，并使用移液槍輕柔的吸打混勻，30℃水浴30 min(中途翻轉6～8次混勻)；將離心管置于42℃水浴15 min(中途翻轉6～8次混勻)，5 000 r·min-1離心40 s，去除上清，用400 μL ddH2O重懸，5 000 r·min-1離心30 s后棄上清，用200 μL ddH2O重懸，最后將重懸菌液涂布于SD/-Leu/-Trp平板，倒置平板于29℃培養箱培養3～5 d。挑取長至2～3 mm的白色菌體，放于2 mL SD/-Leu/-Trp的液體培養基中，29℃、200 r·min-1培養16～18 h，當OD600達到0.2左右時，按1∶10∶100稀釋菌液，各取5 μL分別點種于SD/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X平板上，平板在超凈工作臺內充分吹干后，將平板倒置于29℃培養箱中培養3～4 d，觀察互作情況。

1.2.5 候選互作蛋白的表達分析 將長勢一致的煙草幼苗在相對濕度65%～75%、溫度25℃、14 h光照/10 h 黑暗的人工智能氣候箱中培養，當煙苗生長至5葉時進行4℃低溫處理，以25℃為對照，分別在處理0、6、12、24、36、48、72 h后取第2、第3片展開葉，迅速用液氮處理后放于-80℃冰箱保存備用。每3株混勻作為1個樣品，各3個生物學重復用于實時熒光定量PCR(quautitative real-time PCR, qRT-PCR)。

樣品總RNA用RNAprep pure Plant Kit總RNA試劑盒提取，用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑反轉錄得到的cDNA；根據候選蛋白的cDNA序列，利用Primer Primer5軟件設計熒光引物(表2)，用熒光定量試劑盒Talent qPCR PreMix(SYBR Green)對候選蛋白進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測，步驟參照試劑盒說明書。

表 2 熒光定量PCR引物Table 2 Primer used for real-time PCR

qRT-PCR反應體系為25 μL：2×Talentl qPCR PreMix 12.5 μL、正向引物(10 μmol·L-1)0.75 μL、反向引物(10 μmol·L-1)0.75 μL、cDNA模版2 μL、RNase-free ddH2O 9 μL。qRT-PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，34個循環；72℃延伸5 min，55～94℃進行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算NtMYB4a及候選蛋白基因的相對表達量。利用DPS7.5軟件完成差異顯著性分析，相關分析由R語言軟件完成。

2 結果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a的構建

將合成的NtMYB4a連接到載體pGBKT7上，重組載體質粒轉入DH5α大腸桿菌感受態細胞中，并對所得單克隆進行菌液PCR鑒定，結果如圖1所示，目的片段與基因片段(746 bp)大小一致。抽提大腸桿菌質粒后進行測序，測序結果比對正確，說明pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體構建成功。

注：1～8：隨機挑選的8個克隆；5 000bp DNA Ladder Marker.Note: 1～8:Randomly picked 8 clones. 5 000bp DNA Ladder Marker.圖1 陽性克隆菌液PCR電泳檢測Fig.1 PCR electrophoresis detection of positive clone solution

2.2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體自激活性及毒性檢測

將pGBKT7-NtMYB4a誘餌重組質粒和獵物空載轉化酵母感受態細胞，涂布于DDO、DDO/X、TDO平板進行毒性和自激活檢測，結果如圖2所示。酵母在DDO平板上能正常生長，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；酵母在DDO/X平板能生長且變藍，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7有自激活現象，能夠激活宿主菌報告基因MELl的表達，從而使X-α-gal變藍。酵母能在TDO平板生長，說明誘餌pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7有自激活現象，激活了HIS3報告基因。將pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體涂布于TDO/3′AT平板，酵母在5 mmol·L-1的TDO/3′AT平板上能夠生長，說明5 mmol·L-13′AT不能抑制HIS3報告基因的背景表達；酵母在10 mmol·L-1的TDO/3′AT平板上不能生長，說明10 mmol·L-13′AT能夠抑制HIS3報告基因的背景表達，后續可用TDO/X/3′AT(10 mmol·L-1)進行文庫篩選。

圖2 pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體自激活性及毒性檢測Fig.2 Detection of self-activation and toxicity of pGBKT7-NtMYB4a bait vector

2.3 酵母雙雜交篩選NtMYB4a的互作蛋白

將pGBKT7-NtMYB4a誘餌載體AH109酵母和cDNA文庫Y187酵母進行雜交，利用顯微鏡觀察雜交液中結合生長子的產生情況(圖3-A)，酵母雜交液中有三葉草結構的形成，說明酵母細胞雜交成功。將結合生長子進行加壓培養，在TDO/X/3′AT(10 mmol·L-1) 平板上酵母正常生長(圖3-B)；再進一步加壓培養，將TDO/X/3′AT平板上的78個單克隆全部點種在QDO/A/X平板上進行第2次篩選，觀察菌落的生長情況(圖3-C)，在QDO/A/X平板上有72個藍色菌斑正常生長。

注：A：結合生長子鏡檢圖；B：雜交液TDO平板培養；C：單克隆QDO平板培養。Note：A: Combined with growth microscopy. B: Plate culture of hybrid liquid TDO. C: Monoclonal QDO plate culture.圖3 酵母細胞結合生長圖Fig.3 Diagram of yeast cell binding growth

將經過QDO/A/X培養篩選所得的72個藍色菌株抽提質粒，利用pGADT7通用引物對質粒進行PCR檢測驗證，對表現為陽性所對應的質粒進行測序(圖4)，其中部分蛋白存在高級結構，測序失敗。將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，合并重復序列，去掉載體序列，初步獲得39個可能與NtMYB4a互作的候選蛋白，包括天冬氨酸蛋白酶、N-α-乙酰轉移酶、RALF蛋白質、果糖二磷酸醛縮酶、核糖體蛋白、過氧化氫酶同工酶、鋅指AN1、轉運蛋白SEC13、液泡分選蛋白、B2蛋白、應激增強蛋白等(表3)。

圖4 互作陽性克隆PCR檢測Fig.4 PCR detection of interaction positive clones

表 3 酵母雙雜交篩選的候選NtMYB4a互作蛋白Table 3 Candidate NtMYB4a-interacting proteins screened by Y2H

2.4 回轉驗證互作蛋白

將獵物質粒轉化入大腸桿菌并抽提質粒，然后再將獵物質粒與誘餌質粒共轉化入AH109酵母感受態細胞中，進行酵母回轉驗證。共轉化的酵母菌在 SD/-Leu/-Trp 平板上生長良好(圖5)。將長至2～3 mm的陽性克隆進行1∶10∶100稀釋后，進行加壓培養，發現4、6、14、15、32和33號靶蛋白在缺陷培養基 SD/-Leu/-Trp、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X平板上均能正常生長，并能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X 平板上長出藍色菌落(圖6)，說明4、6、14、15、32和33號靶蛋白排除了假陽性的可能，與煙草NtMYB4a具有相互作用。

圖5 共轉化酵母SD/-Leu/-Trp平板生長情況Fig.5 Growth of SD/-Leu/-Trp plates of co-transformed yeast

圖6 回轉驗證互作蛋白Fig.6 Rotation verification of interacting proteins

2.5 與NtMYB4a互作的候選蛋白的功能預測

測序經BLAST比對及酵母回轉驗證后，最終獲得6個與NtMYB4a互作的陽性靶蛋白，其功能預測如表4所示。

表4 酵母雙雜交篩選的候選NtMYB4a互作蛋白功能預測Table 4 Candidate NtMYB4a-interacting proteins and its functional prediction screened by Y2H

2.6 低溫脅迫下NtMYB4a與候選蛋白基因的表達分析

由圖7所示，NtB2、NtSEP1、NtVPS20與NtMYB4a的表達模式一致，呈倒“V”型，表現為0至24 h逐漸增加，并在24 h時達到最大值，36 h時降到最低值；而NtAN15K、NtRALF22和NtAPN1K基因的表達變化模式相似，呈“N”型，不同的是NtAN15K在12 h時增加到最大值后降低，而NtRALF22在24 h時增加到最大值后降低，三者都在36 h時降低，48 h時顯著升高。

圖7 低溫脅迫下相關蛋白基因的動態變化模式Fig.7 Dynamic change patterns of related protein genes under low temperature stress

NtMYB4a、NtB2、NtAN15K、NtRALF22和NtVPS20這5個基因表達水平在12、24 h都較0 h顯著增加。綜上所述，在低溫脅迫下，6種候選蛋白基因和NtMYB4a基因的表達均整體呈增加—降低—增加的變化趨勢。

基因表達相關性分析(圖8)表明，NtVPS20和NtB2與NtMYB4a呈顯著正相關關系；NtRALF22和NtSEP1與NtMYB4a呈正相關關系；NtAN15K和NtAPN1K與NtMYB4a呈較弱負相關關系。NtRALF22和NtB2與其他5種蛋白互為正相關關系；NtAN15K與NtSEP1、NtVPS20呈負相關關系。

注：無圓圈方格表示各指標間無顯著性差異，藍色表示正相關，紅色表示負相關；圓圈越大、顏色越深表示指標間相關性越顯著。Note: Uncircled squares indicate that there is no significant difference among indicators, blue indicates positive correlation, red indicates negative correlation. The larger the circle and the darker the color, the more significant the correlation between indicators.圖8 低溫脅迫后NtMYB4a與互作蛋白基因表達的相關性分析Fig.8 Correlation analysis of NtMYB4a and interacting protein gene expression under low temperature stress

3 討論

酵母雙雜交技術的產生是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究[7]。該技術在核酸水平上操作，避免了蛋白質的分離和純化過程，保證了蛋白質的活性，也能夠直接真實地反映蛋白之間的互作用。因此，酵母雙雜交技術具有靈敏度較高、操作簡潔，且在一定程度上體現了細胞內部情況[2]的特點。但此方法具有一定的局限性，如假陽性和假陰性率較高。屈瑩[8]通過酵母雙雜交初步篩選到40個蛋白與BsMYB62互作，驗證后得到12個候選互作蛋白。楊潔[9]通過酵母雙雜交初步篩選到236個與SmMYB36互作的蛋白，分析驗證后得到28個候選互作蛋白。若誘餌蛋白和獵物蛋白單獨或結合后存在毒性，酵母細胞的正常生長會受到影響，引起假陰性現象；若誘餌蛋白存在自激活性，獵物蛋白與之結合后同樣存在自激活性，可激活報告基因，從而引起假陽性現象[10]。目前通常通過配置不同濃度的缺陷培養基、回轉驗證互作蛋白等試驗方法降低假陽性現象。劉靜等[11]選用含45 mmol·L-13-AT的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培養基進行文庫篩選，可抑制pGBKT7-BsMYB62的自激活現象；張竹君等[12]篩選后使用0.2 mg·L-1ABA濃度下的SD/-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA缺陷培養基對pGBKT7-RhRD22誘餌蛋白無自激活效應，并用其進行文庫篩選。本研究構建的誘餌載體pGBKT7-NtMYB4a無毒性但有自激活現象，經過篩選發現10 mmol·L-13′AT的SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal缺陷培養基可抑制pGBKT7-NtMYB4a的自激活現象。利用該培養基對煙草cDNA文庫進行篩選，初步獲得39個可能與NtMYB4a互作的候選蛋白。為進一步降低假陽性的概率，采用回轉驗證方法進一步篩選，得到6個陽性蛋白，分別是RALF-like 22蛋白、鋅指A20/AN1結構域蛋白、液泡分選蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和應激增強蛋白。

采用qRT-PCR技術分析以上6個基因在4℃低溫脅迫下的表達模式，發現上述基因均與NtMYB4a的表達模式相似，其中NtVPS20和NtB2的表達與NtMYB4a的表達呈顯著正相關關系。液泡分選蛋白(Vacuolar sorting protein, Vps)是一類介導細胞器間物質轉運的蛋白[13]，參與植物的生長發育、應答生物與非生物脅迫等。如油茶(CamelliaoleiferaAbel)CfVPS26參與調控果生刺盤孢生長發育[14]；黃瓜(CucumissativusL.)CmVPS參與黃瓜花葉病(CucumberMosaicVirus，CMV)的調控，有抑制CMV表達的作用[15]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtVPS25參與調控主根發育[16]。低溫脅迫下AtVPS28A和AtVPS28B參與質膜上的生長素運輸載體蛋白PIN1的表達，調節相關代謝物的平衡，從而增強植物的耐寒性[17]，因此，結合前人發現和本研究結果推測，NtMYB4a可能與NtVPS20互作，影響生長素對低溫的應答。而B2蛋白是一個由RNA3編碼的含有106個氨基酸的小蛋白，在辣椒[18]中具有抗病性，小麥[17]中通過改變脫落酸的信號傳導響應干旱脅迫，從而調控植物生長。但NtMYB4a與NtB2是否形成復合蛋白來響應環境脅迫有待進一步研究。

其余4個候選互作蛋白基因雖然在低溫脅迫下的表達與NtMYB4a的相關性不顯著，但也有相關研究表明他們參與植物生長發育、應答生物或非生物脅迫等過程。快速堿化蛋白(Rapid alkalinization factors，RALFs)是近年來新發現的一種植物多肽類信號分子，具有參與植物生長發育調控的生理作用[20]，如阻止根系生長和發育[21]、參與調控植物花粉與雌蕊之間的互作[22]等。A20/AN1型鋅指蛋白(Zinc-finger proteins, ZFPs)是一類含有A20鋅指、AN1鋅指或二者并存的蛋白質[23]，在植物中有參與非生物脅迫應答的功能[24]，如水稻OsSAP[25-26]和番茄SAP[27]參與響應干旱、低溫、鹽等逆境脅迫。天冬氨酸蛋白(Aspartic proteinase)參與了植物體內細胞器的降解、蛋白質的加工和降解過程及激素調控的衰老機制等過程[28]，還參與植物逆境脅迫反應，響應干旱脅迫的應答[29-30]。煙草應激增強蛋白1來源于葉綠體，但關于其功能方面的研究較少。本課題組前期研究發現NtMYB4a基因參與響應PEG、鹽、低溫和MeJA等非生物脅迫的響應，還參與花青素、綠原酸的合成[31]。本研究僅采用qRT-PCR驗證了這6個基因在低溫下與NtMYB4a的共表達情況，無顯著相關性的4個候選蛋白可能與NtMYB4a互作參與調控煙草的生長發育過程，或響應除低溫脅迫外的非生物脅迫。后期將通過免疫共沉淀和雙分子熒光互補等技術進一步證實6個候選互作蛋白與NtMYB4a的互作關系，并對其進行功能驗證，為揭示NtMYB4a與其互作參與調控煙草響應非生物脅迫或參與花青素合成的分子機制提供依據。

4 結論

本研究通過構建PGBKT7-NtMYB4a誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術，從煙草cDNA文庫篩選到6個與NtMYB4a互作的蛋白，分別是煙草RALF-like 22(NtRALF22，XP_016459104.1)、煙草鋅指A20/AN1結構域(NtAN1，XP_016468512.1)、煙草液泡蛋白分選蛋白(NtVPS20，XP_009590586.1)、煙草天冬氨酸蛋白酶(NtAPN1K，XP_016511411.1)、煙草B2蛋白(NtB2，XP_016497753.1)和煙草應激增強蛋白1(NtSEP1，XM_016495253.1)。qRT-PCR分析結果表明低溫脅迫下這6個候選互作蛋白的基因表達模式與NtMYB4a表達相似，其中NtVPS20和NtB2的表達與NtMYB4a的表達呈顯著正相關，推測NtMYB4a可能與這2種蛋白互作參與煙草低溫響應。