基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)的甘薯HRM分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用

馮俊彥 郎 濤 張 聰 李 明 青莉芳 屈會(huì)娟蒲志剛,* 康 樂(lè)

(1 西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637002；2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610061)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料作物[1]。在我國(guó)，甘薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)保障我國(guó)糧食與能源安全具有重要作用[2]。甘薯富含多糖、多酚等多種活性成分[3]，具有重要的醫(yī)療保健作用[4]，越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞。

甘薯是六倍體(2n=6X=90)作物，染色體多，基因組大，雜合度高，在基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建等研究上比其他作物困難[5]。目前甘薯遺傳研究主要使用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)分子標(biāo)記技術(shù)[6-7]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)[8-9]等，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標(biāo)記[10]、轉(zhuǎn)座子插入標(biāo)記(retrotransposon insertion polymorphisms, RIP)[11]、啟動(dòng)密碼子靶向(start codon targeted polymorphism,SCoT)標(biāo)記[12]等也有報(bào)道。與水稻、玉米等主要作物目前廣泛使用的高通量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分子標(biāo)記技術(shù)相比，上述傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)不能充分滿(mǎn)足研究的需要。

近年來(lái)測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展，給生物技術(shù)研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持[13]，其中簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(reduced-representation genome sequencing, RRGS)技術(shù)是最具有應(yīng)用前景的技術(shù)之一。該技術(shù)主要通過(guò)酶切技術(shù)降低物種基因組復(fù)雜程度，再針對(duì)基因組特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，從而獲得基因組序列信息。目前該技術(shù)已發(fā)展出多種類(lèi)型，主要包括特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF)[14]、限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序(restriction-site associated DNA, RAD)[15-16]、基因分型測(cè)序(genotyping by sequencing, GBS)[17]等，其中應(yīng)用較為廣泛的是RAD測(cè)序技術(shù)。RAD測(cè)序技術(shù)具有高度的穩(wěn)定性，可以獲得大量的遺傳多態(tài)性。與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，RAD測(cè)序技術(shù)在發(fā)掘SNP方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，而且操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)費(fèi)用低，對(duì)無(wú)參考基因組的物種也可以進(jìn)行大規(guī)模SNP位點(diǎn)篩查[18]。目前RAD測(cè)序技術(shù)已成功應(yīng)用于超高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、重要經(jīng)濟(jì)性狀定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化分析等研究[15-16]，并已成為甘薯遺傳研究最理想的研究技術(shù)之一[16]。

目標(biāo)SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型是首先需要解決的問(wèn)題。迄今已開(kāi)發(fā)出雜交法、DNA測(cè)序法、微陣列芯片法、酶切法等20多種SNP分型方法[19]。相比其他方法，高分辨率溶解(high resolution melt, HRM)技術(shù)具有簡(jiǎn)便快速、通量高、成本低等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)是在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性過(guò)程中，實(shí)時(shí)檢測(cè)體系內(nèi)熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型[20]。在動(dòng)植物基因分型、突變掃描等研究中已得到廣泛應(yīng)用[21-22]。

目前，關(guān)于甘薯單核苷酸多態(tài)性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的研究較少[23-24]，因此本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析甘薯簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選穩(wěn)定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)基于HRM技術(shù)的分子標(biāo)記，旨在為SNP分子標(biāo)記在甘薯研究中的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共收集國(guó)內(nèi)外甘薯種質(zhì)材料69份，其中國(guó)外種質(zhì)材料7份、國(guó)內(nèi)育成品種(系)49份、地方品種13份，全部試驗(yàn)材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所收集保存(表1)。本研究使用的PCR試劑盒、DNA提取試劑盒、熒光染料均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 甘薯種質(zhì)材料信息Table 1 The information of sweetpotato accessions

1.2 儀器與設(shè)備

5425R微型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；T100-PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)Thermo公司；Hise 2500測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；DYY-2C電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司；Lightscanner-Instrument 96高通量熔解曲線分析儀，美國(guó)Idaho-Technology公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘薯基因組DNA提取 2019年6月，將全部參試甘薯種質(zhì)材料種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所新都試驗(yàn)基地。同年8月，選取各材料幼嫩葉片0.3 g，液氮冷卻帶回四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所生物技術(shù)育種工程中心，使用CTAB法提取各材料基因組DNA[25]。用超純水充分溶解DNA后，抽取2 μL加5 μL上樣緩沖液，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量。使用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度。根據(jù)DNA濃度，將DNA原液稀釋到100 ng·μL-1，-20℃冷凍待用。

1.3.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序及分析 根據(jù)RAD-Seq測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建要求制備基因組DNA文庫(kù)。先利用不同限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)基因組DNA分別進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切試驗(yàn)結(jié)果選擇限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和NlaIII對(duì)甘薯基因組DNA進(jìn)行酶切。按照RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序建庫(kù)方法，構(gòu)建長(zhǎng)度范圍在300～400 bp的雙端測(cè)序(pair-end)文庫(kù)。最后利用Ilumina HiSeq雙端測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

用Stacks v1.40軟件過(guò)濾原始測(cè)序數(shù)據(jù)[26]，去除接頭序列、低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)、接頭序列不明確的序列，以及長(zhǎng)度小于指定長(zhǎng)度的序列。選取過(guò)濾后測(cè)序片段長(zhǎng)度的15%進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，保留質(zhì)量高于10的序列。根據(jù)相同酶切位置測(cè)序片段之間的相似性，進(jìn)行計(jì)數(shù)并獲得每個(gè)接頭序列的數(shù)目和深度信息。為保證后續(xù)獲得準(zhǔn)確的SNP位點(diǎn)，過(guò)濾掉接頭序列中5′端非酶切位點(diǎn)為ATC起始的序列和深度值為1的序列，統(tǒng)計(jì)數(shù)目和深度。利用Stacks v1.40軟件中的無(wú)參考基因組分析方法，將個(gè)體內(nèi)的測(cè)序片段進(jìn)行內(nèi)部比對(duì)，生成各個(gè)材料的stacks文件，再對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行兩兩比對(duì)，比對(duì)時(shí)允許的錯(cuò)配數(shù)為2。整合深度信息和比對(duì)結(jié)果信息，過(guò)濾掉數(shù)據(jù)缺失大于30%的分型結(jié)果。利用最大似然法得到高可信度的SNP基因型結(jié)果[27]。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)合成及PCR條件 根據(jù)含有高可信度SNP的測(cè)序片段序列信息，篩選SNP位點(diǎn)位于序列30～90區(qū)間內(nèi)，且僅有1～2個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)的序列，使用BatchPrimer3 (http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)，設(shè)計(jì)特異PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系10 μL：50 ng·μL-1植物基因組DNA 2 μL，10×buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.8 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各加0.25 μL，5 unit·μL-1Taq酶0.1 μL，10×Evagreen熒光染料1.0 μL，10 μmol·L-1高、低溫內(nèi)標(biāo)各加1.0 μL，最后加去離子水2.0 μL補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸45 s， 36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 min，慢慢冷卻至12℃。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 將PCR反應(yīng)板中的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移8.5 μL至上樣板中，每孔加入15 μL礦物油離心后，將上樣板放入Lightscanner儀器中，進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)程序包括采集62～95℃之間熒光信號(hào)變化數(shù)據(jù)，升溫速率設(shè)定為0.1℃·s-1。

PCR產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液(40%蔗糖，0.025%溴酚藍(lán))，用1.5%(w/v)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。在熒光成像儀上檢測(cè)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

數(shù)據(jù)采集完成后，使用Lightscanner儀器自帶的溶解曲線分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。在分析過(guò)程中，根據(jù)儀器提示或手動(dòng)剔除PCR無(wú)擴(kuò)增的樣本，高低溫內(nèi)標(biāo)根據(jù)掃描結(jié)果手動(dòng)設(shè)置，以樣本曲線高、低溫內(nèi)標(biāo)曲線峰的最高點(diǎn)作為高低溫內(nèi)標(biāo)的溫度點(diǎn)。然后分析各樣本熔解曲線的分型結(jié)果。檢測(cè)各樣本分型檢測(cè)，對(duì)個(gè)別未正確分型的樣本，進(jìn)行手動(dòng)矯正。

利用Excel 2007軟件對(duì)分型數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，并進(jìn)行數(shù)據(jù)相應(yīng)格式轉(zhuǎn)化。利用SPSS 16.0軟件的聚類(lèi)分析模塊，對(duì)參試材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果分析

為盡可能多挖掘甘薯基因組中遺傳多樣性豐富的SNP位點(diǎn)，本研究根據(jù)多年田間表型鑒定數(shù)據(jù)以及品種來(lái)源信息，選取23個(gè)遺傳多樣性豐富的甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，共獲得54.13 Gb數(shù)據(jù)，從中過(guò)濾掉序質(zhì)量小于9的數(shù)據(jù)和不符合要求的數(shù)據(jù)后，得到樣本測(cè)序數(shù)據(jù)的Q20值最大為96.26%，最小為93.44%，平均Q20值為95.42%。Q30值最大值為90.63%，最小為85.60%，平均Q30值為89.16%。

對(duì)23個(gè)甘薯品種原始測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后，獲得高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)38.18 Gb數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣本獲得1.66 Gb數(shù)據(jù)，共獲得155 467 607個(gè)雙端測(cè)序片段以及 7 216 825 個(gè)單端測(cè)序片段。共獲得RAD標(biāo)簽 11 739 112 個(gè)，單個(gè)材料最大為612 312個(gè)，最小為369 969個(gè)，平均每個(gè)樣本獲得510 396個(gè)。共獲得 155 751 596 個(gè)測(cè)序片段，平均每個(gè)樣本獲得6 771 809 個(gè)。通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣本中獲得的總測(cè)序片段數(shù)與其總RAD標(biāo)簽數(shù)比值，獲得測(cè)序深度，23份材料的測(cè)序深度處于9.87～16.44之間，平均測(cè)序深度為13.08。不同樣本的原始數(shù)據(jù)分布范圍為6 433 720～28 746 118，平均 10 541 122 (表2)。利用Stacks v1.40軟件進(jìn)一步過(guò)濾數(shù)據(jù)并對(duì)樣本之間進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)346 609個(gè)片段含有多態(tài)性單核苷酸位點(diǎn)，共檢測(cè)到835 756個(gè)SNP位點(diǎn)。

表2 甘薯種質(zhì)材料的RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 The statistic raw reads of RAD sequencing of sweetpotato accessions

2.2 單核苷酸分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

為確保SNP數(shù)據(jù)的可靠性，以簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析獲得的SNP數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)SNP進(jìn)行再次嚴(yán)格過(guò)濾，確保單個(gè)SNP在95%以上的測(cè)序樣本(≥22個(gè))中被檢測(cè)到，并對(duì)單個(gè)測(cè)序片段中出現(xiàn)3個(gè)以上的SNP位點(diǎn)的序列進(jìn)行過(guò)濾，最后選取3 650個(gè)高質(zhì)量測(cè)序片段。根據(jù)高分辨率熔解曲線技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段在100 bp左右的要求，進(jìn)一步對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行了篩選，只保留SNP位點(diǎn)位于序列36～90 bp范圍僅有1～2個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，且主要變異類(lèi)型為A/C、A/G、T/C、T/G類(lèi)型的序列，利用BatchPrimer3在線程序設(shè)計(jì)引物。針對(duì)1個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)成功開(kāi)發(fā)54對(duì)引物，針對(duì)2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)成功開(kāi)發(fā)80對(duì)引物。為驗(yàn)證開(kāi)發(fā)引物，選取8個(gè)甘薯品種DNA作為模板，使用高分辨率溶解曲線技術(shù)，分別對(duì)134對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，134對(duì)引物中，112對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物，占總引物的83.58%，22對(duì)引物沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，占總引物的16.42%。在有擴(kuò)增產(chǎn)物的134對(duì)引物中，15對(duì)(11.19%)對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果為多峰，擴(kuò)增產(chǎn)物不止一個(gè)，36對(duì)(26.87%)引物在8個(gè)樣本中僅有一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，樣本之間沒(méi)有差異，61對(duì)(45.52%)引物在8個(gè)樣本中的擴(kuò)增特異性好，僅有一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，而且樣本之間有差異，其中，27對(duì)引物之間差異較小，可以對(duì)小樣本的不同基因型進(jìn)行區(qū)分(表3)。34對(duì)引物擴(kuò)增多態(tài)性豐富，差異顯著。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物單一的引物，瓊脂糖電泳驗(yàn)證結(jié)果表明，這些引物僅有1條100 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物，特異性良好(圖1)。

表3 擴(kuò)增多態(tài)性引物信息Table 3 The amplified polymorphic primer information

注：Marker:DNA Marker，標(biāo)準(zhǔn)條帶分別為100、250、500 bp；1～4: 不同的參試材料。Note: Marker:DNA Marker. The size of bands is 100, 250, 500 bp, respectively. 1～4: Different sweetpotato accessions.圖1 部分Hrm-bat引物在參試材料中擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretogram result amplified by primer Hrm-bat in different accessions

2.3 基于HRM檢測(cè)技術(shù)的分子標(biāo)記多態(tài)性分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證新開(kāi)發(fā)引物在不同來(lái)源甘薯種質(zhì)中的應(yīng)用價(jià)值，在初步篩選的基礎(chǔ)上，選取34對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物單一，差異顯著，且多態(tài)性豐富的引物，對(duì)本課題組近年來(lái)收集、保存且具有代表性的育成甘薯品種、地方甘薯品種、引進(jìn)甘薯品種及部分測(cè)序甘薯品種共52份進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，34對(duì)Hrm-bat引物在52份甘薯種質(zhì)材料共檢測(cè)到296個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到8.71個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(圖2)。引物Hrm-bat54、Hrm-bat69檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)最多，分別檢測(cè)到14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。引物Hrm-bat25、Hrm-bat89、Hrm-bat100、Hrm-bat107檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)最少，分別檢測(cè)到5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選到14對(duì)引物檢測(cè)到的10個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)，分別是Hrm-bat15、Hrm-bat30、Hrm-bat45、Hrm-bat46、Hrm-bat54、Hrm-bat57、Hrm-bat61、Hrm-bat69、Hrm-bat72、Hrm-bat85、Hrm-bat90、Hrm-bat95、Hrm-bat111。

注：本圖片為L(zhǎng)ightscanner儀器自帶軟件分析結(jié)果。橫坐標(biāo)是溫度值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)化熒光信號(hào)值。Note:The picture shows the analysis results of the Lightscanner instrument’s software. The abscissa is the temperature and the ordinate is the normalized fluoresence.圖2 部分Hrm-bat引物在8份甘薯材料中的HRM檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Applications of some Hrm-bat primers in 8 sweetpotato accesssions with HRM

為驗(yàn)證Hrm-bat分子標(biāo)記在甘薯種質(zhì)材料間的多態(tài)性，本研究對(duì)Hrm-bat分子標(biāo)記在52份甘薯種質(zhì)材料中的掃描結(jié)果進(jìn)行材料間的比對(duì)分析(圖3)，結(jié)果表明，34個(gè)Hrm-bat分子標(biāo)記在甘薯種質(zhì)1-24和紫色觀賞中獲得的多態(tài)性位點(diǎn)最多，有30個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，多態(tài)性率達(dá)到90.91%。甘薯種質(zhì)2019516161和川菜薯211之間的差異最小，僅得到9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性率只有27.27%。所有Hrm-bat在全部參試材料間的平均多態(tài)性達(dá)到59.35%。以上結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的Hrm-bat分子標(biāo)記在甘薯種質(zhì)材料間具有豐富的遺傳多態(tài)性，可以用于發(fā)掘甘薯種質(zhì)材料之間的遺傳多樣性研究。

圖3 部分Hrm-bat引物在52份參試材料中的HRM檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Applications of some Hrm-bat primers in 52 sweetpotato accessions with HRM

2.4 甘薯種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

基于34對(duì)Hrm-bat分子標(biāo)記對(duì)52份參試甘薯種質(zhì)材料的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用SPASS V16.0軟件計(jì)算不同材料間平方Euclidean距離，使用系統(tǒng)聚類(lèi)法的組間聯(lián)結(jié)法進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，52份參試材料可分為兩大類(lèi)，其中第一大類(lèi)群包含51份甘薯材料(圖4)；另一大類(lèi)群僅包括1份紫色觀賞甘薯材料，該材料以臺(tái)灣紫秧為母本，通過(guò)放任授粉選育得到。

在聚類(lèi)圖重新標(biāo)定距離約5.5處，第一大類(lèi)又被劃分為5個(gè)小類(lèi)群。其中，第一小類(lèi)群最大，包含41份甘薯材料，占總材料的78.85%。該類(lèi)群包括5個(gè)亞群，第一亞群包括5份材料，其中福薯18、北京553、冀紅肉江88、廣菜2號(hào)關(guān)系較近，香芋薯關(guān)系較遠(yuǎn)。第二亞群為最大群，包含18份材料，分為4組，4組之間關(guān)系較近，甘薯骨干親本南瑞苕也在本類(lèi)群中。第三亞群包括10份甘薯材料，分為兩組，包含了甘薯骨干親本徐薯18。第四亞群包括5份材料，其中，地方品種170和湘薯15之間、日紫9號(hào)和福薯604之間關(guān)系較近，冀19-40關(guān)系較遠(yuǎn)。3份材料(川薯383、良種苕、西城薯007)與其他材料關(guān)系較遠(yuǎn)，聚為一個(gè)亞群(圖4)。

圖4 基于Hrm-bat分子標(biāo)記的52份甘薯種質(zhì)材料平均連鎖聚類(lèi)圖Fig.4 Dendrogram of 52 sweetpotato accessions using average linkage based on Hrm-bat molecular markers

第二小類(lèi)群包含3份材料，分別是菜薯5號(hào)、金瓜黃11、2019513002。第三類(lèi)群包括2份材料，分別是湘薯15號(hào)、無(wú)外苕。第四小類(lèi)群包含紅紅苕、濟(jì)薯26、贛薯22、綿早秋共4份材料，其中紅紅苕、濟(jì)薯26、贛薯22關(guān)系較近，地方品種綿早秋關(guān)系較遠(yuǎn)。第五小類(lèi)群包含日紫1號(hào)1份材料(圖4)。從聚類(lèi)圖可知，日紫1號(hào)與其他材料之間的關(guān)系較遠(yuǎn)，可能與其國(guó)外來(lái)源有關(guān)。

整體來(lái)看，聚類(lèi)圖中參試52份甘薯種質(zhì)材料之間遺傳關(guān)系較近，大部分選育品種之間差異較小，這可能與我國(guó)甘薯育種中廣泛使用少數(shù)材料作為親本，選育出的品種間親緣關(guān)系較近有關(guān)。相對(duì)而言，一些引進(jìn)材料和地方品種的遺傳差異較大，可作為育種親本使用，從而進(jìn)一步豐富品種的遺傳多樣性。

3 討論

目前，甘薯研究中主要使用的分子標(biāo)記仍然是非特異性、傳統(tǒng)型分子標(biāo)記[28-29]。相比傳統(tǒng)分子標(biāo)記，SNP分子標(biāo)記在基因組中分布廣泛，標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)型分子標(biāo)記[30]，但是目前該標(biāo)記在甘薯研究應(yīng)用較少。

測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為甘薯研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐，甘薯及其近緣種I.trifida和I.triloba基因組測(cè)序工作相繼完成[31-32]。在眾多測(cè)序技術(shù)中，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)在發(fā)掘基因組SNP多態(tài)性方面優(yōu)勢(shì)也逐漸顯現(xiàn)[33]，目前已開(kāi)發(fā)出多種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，這些技術(shù)已經(jīng)在甘薯超高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化分析等研究中得到廣泛應(yīng)用[34]。本研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行了測(cè)序分析，在甘薯基因組中檢測(cè)到835 756個(gè)SNP位點(diǎn)，從中篩選了一批多態(tài)性高、穩(wěn)定好的SNP位點(diǎn)，用于開(kāi)發(fā)SNP分子標(biāo)記。同時(shí)，本研究將簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到甘薯基因組SNP發(fā)掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)上，充分發(fā)揮了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)高通量、快速、低成本的優(yōu)勢(shì)，為今后甘薯SNP分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了參考。

近年來(lái)，SNP分子標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，研究人員已開(kāi)發(fā)出多種SNP檢測(cè)技術(shù)。相比其他檢測(cè)技術(shù)，HRM技術(shù)操作簡(jiǎn)單、靈敏高效，能夠開(kāi)展高通量、低成本的操作，可以有效區(qū)分SNP、SSR和InDel等不同類(lèi)型變異的雜合與純合狀態(tài)，在水稻、玉米、小麥等作物的遺傳及分子標(biāo)記輔助選育研究上得到了廣泛應(yīng)用[20-22]。因此，本研究根據(jù)HRM技術(shù)要求設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)引物，以簡(jiǎn)化基因組測(cè)序篩選到含有SNP多態(tài)性位點(diǎn)的測(cè)序片段為參考，成功開(kāi)發(fā)出134對(duì)分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的驗(yàn)證，篩選到98對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，利用HRM技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同基因型的準(zhǔn)確區(qū)分。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究開(kāi)發(fā)的引物在甘薯種質(zhì)材料中的多態(tài)性，本研究選取了34對(duì)多態(tài)性高的引物對(duì)52份甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行了分型，發(fā)現(xiàn)平均每對(duì)引物檢測(cè)到8.71個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，最多可以檢測(cè)出15個(gè)基因型，最少仍可檢測(cè)出5個(gè)基因型。初步證明本研究開(kāi)發(fā)的HRM分子標(biāo)記在甘薯種質(zhì)材料中具有豐富的多態(tài)性，在今后甘薯分子標(biāo)記研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

利用本研究開(kāi)發(fā)Hrm-bat分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)52份甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，52份材料件相似性很高，多數(shù)材料的差異在5.5以下，這與我國(guó)甘薯育種中使用親本較少，育成品種遺傳背景狹窄有密切關(guān)系，與前人研究結(jié)果基本一致[35-36]。78.85%的參試材料被聚到一個(gè)類(lèi)群中，其中包含了甘薯骨干親本南瑞苕和徐薯18，這可能與我國(guó)大量甘薯品種含有骨干親本其血緣有關(guān)[37-38]。相比較而言，聚類(lèi)圖顯示甘薯地方品種和國(guó)外引進(jìn)品種的遺傳差異較大。建議在今后甘薯育種中盡量選用地方品種和國(guó)外甘薯品種，以更好地拓寬甘薯遺傳背景[39]。在聚類(lèi)圖中一些地方品種、國(guó)外引進(jìn)品種與育成品種有聚集，推測(cè)這些品種間存在親緣關(guān)系，具體原因還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)甘薯地方品種、引進(jìn)品種及育成品種進(jìn)行了測(cè)序分析，成功開(kāi)發(fā)出基于HRM技術(shù)的甘薯特異SNP分子標(biāo)記，并將部分分子標(biāo)記應(yīng)用于甘薯親緣關(guān)系分析，為今后甘薯SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了參考。