手掌參多糖對60Co-γ射線輻射小鼠造血和抗氧化功能損傷的治療作用研究

馮洋洋 李杭雨 張琳梓 劉前虔 吳代燕 梁海川 封海波

(西南民族大學畜牧獸醫學院， 四川 成都 610041)

手掌參(Gymnadeniaconopsea)生長在海拔3 000～4 000 m的高原地帶，在川藏等地分布廣泛，藏藥名稱為“旺拉”，屬蘭科手參屬植物手參或粗脈手參的塊根。手掌參所含營養成分主要為糖類、粗纖維以及蛋白質，其中總糖含量可達39.27%[1]。手掌參具有諸多藥用活性，在中藥、蒙藥、藏藥中都是極為珍貴的藥材[1-2]，主要用于治療腎虛、體虛、腰酸腿疼、機體疲勞等癥狀，同時手掌參多糖在抗氧化衰老、理氣和血、提高機體免疫力、止痛等方面的功效也逐漸被發現[3]，為輻射損傷的治療提供了基礎。隨著電離輻射在周圍環境中的不斷滲透，輻射損傷已經給人們帶來巨大的困擾[4]。電離輻射可造成機體骨髓造血功能障礙，外周血淋巴細胞和白細胞減少，以及免疫器官損傷，導致免疫功能下降，并引起脂質氧化反應并產生自由基，總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性下降，骨髓嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte, PCE)微核數目增多甚至染色體發生畸變，導致機體各種損傷和疾病，嚴重時還可誘發癌變[5]。現有抗輻射藥物多以化學藥物為主，存在毒副作用大、應用性低等缺點，因此開發高療效、低副作用的天然輻射防治藥物具有良好的應用前景。藏藥是中華民族的瑰寶，許多藏藥中的多糖類或黃酮類等物質可以清除自由基，保護造血系統，提高機體的免疫力和抗氧化能力[6]。

本試驗在前期研究基礎上，進一步研究了不同劑量的手掌參多糖對60Co-γ輻射損傷的治療作用。通過對一定輻射劑量的小鼠灌胃手掌參多糖提取物，研究其對造血系統、抗氧化能力和免疫力的影響，以期為手掌參及其提取物的深入研究與開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

UV-5100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LH750型全自動血細胞分析儀，美國Beckman Coulter公司；RE-5203旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；FACScan流式細胞儀，美國Becton-Dickinson公司；RE-5203循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；Nicolet iS50紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

蛋白定量(total protein, TP)試劑盒(雙縮脲法)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)試劑盒(羥胺法)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)試劑盒(比色法)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(TBA法)均購自南京建成生物研究所；小牛血清，美國HyClone公司；大鼠抗小鼠 CD3+-PE、CD4+-FITC和 CD8+-FITC抗熒光染料，美國Biolegend 公司；甲醇、無水乙醇、冰醋酸、二甲苯，分析純，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 輻射處理

60Co-γ射線輻射在四川省農業科學院輻照中心進行。輻射劑量率為0.8 Gy·min-1，單次均為全身照射。

1.3 試驗動物

昆明小鼠購自四川成都達碩生物科技有限公司。48只健康雌性昆明小白鼠(6～8周齡，體重20～25 g)，給予小鼠正常飲食飲水，適應性飼養7 d。試驗過程中對動物的操作和處置嚴格遵循動物倫理學相關要求。

1.4 試驗方法

1.4.1 手掌參多糖的提取 將手掌參塊莖粉碎，粉末用75%乙醇以1∶15體積比在60℃條件下水浴4 h，4 000 r·min-1離心去上清液，粉末再提取一次，然后收集殘渣在60℃干燥箱中干燥，再在研缽中將已處理好的手掌參研磨成細小粉末，過篩，并將其收集備用。稱取10 g手掌參粉末，加入200 mL無水乙醇于圓底燒瓶中80℃加熱回流，進行脫脂。樣品干燥后，加入250 mL蒸餾水將其溶解，100℃加熱回流，提取2次，合并2次提取液并在旋轉蒸發儀上濃縮至100 mL。加3倍體積無水乙醇靜置過夜，離心取沉淀，加入250 mL三氯乙酸(10%)使沉淀溶解脫蛋白。依次用無水乙醇、丙酮反復洗滌3次。40℃烘干后磨成粉即得手掌參多糖樣品[7]。

1.4.2 手掌參多糖含量及結構的測定 稱取適量葡萄糖，置于 105℃干燥箱中干燥使之達到恒重，然后用去離子水制備成濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。分別取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL上述標準溶液，用去離子水將其定容到2 mL，分別加入1 mL苯酚溶液(5%)，再分別緩慢加入5 mL濃硫酸，將混合物搖勻后，室溫下靜置20 min，用紫外可見分光光度計在490 nm波長處檢測吸光度值，以葡萄糖標準溶液所測得的吸光度(y)為縱坐標，其相應濃度(x)為橫坐標，擬合回歸方程和相關系數。

精確稱取1.4.1所得手掌參多糖樣品，用去離子水制備成0.1 mg·mL-1的多糖溶液，測得的吸光度值(方法同上)代入對應的方程式中，按照以下公式計算樣品手掌參多糖含量：

手掌參多糖含量=(C×V×D)/(W×106)×100%

式中，C：對應方程式上糖的濃度，μg·mL-1；V：定容體積，mL；D：稀釋倍數；W：手掌參樣品取樣質量，g。

將手掌參多糖置于研缽中，加入少許溴化鉀(KBr)粉末與之混合，研磨成均勻細粉。取適量粉末壓片，將壓好的薄片在4 000～400 cm-1范圍內采用紅外光譜儀進行掃描，并記錄相關數據。

1.4.3 試驗動物分組 本研究選用48只健康雌性昆明小白鼠(6～8周齡，體重25～30 g)，隨機分為8組，每組6只。空白組和手掌參多糖低、中、高給藥組不照射，空白組灌胃生理鹽水0.5 mL，給藥組每日分別灌胃濃度為 150、300和600 mg·kg-1手掌參多糖0.5 mL；輻射組及輻射手掌參多糖低、中、高給藥組用5 Gy60Co-γ 射線(劑量率0.8 Gy·min-1) 進行照射，輻射組在輻射后與空白組同時灌胃生理鹽水；輻射給藥低、中、高劑量組在照射后與相對應的不同劑量給藥組同時灌胃手掌參多糖0.5 mL；以上灌胃均連續5 d。第6天測量小鼠體重，眼底靜脈采血以待血常規檢測，小鼠頸椎脫臼處死，剖取相應器官待測。

1.4.4 外周血細胞計數和分類檢測 小鼠眼底靜脈采血，于全自動血細胞分析儀上測定小鼠外周血中紅細胞、白細胞和淋巴細胞等血細胞水平。

1.4.5 脾臟指數測定 小鼠頸椎脫臼處死，解剖取脾臟，去除黏附組織及血液，吸水紙吸干稱重，按照以下公式計算脾臟指數：

脾臟指數=臟器質量(mg)/動物體質量(g)。

1.4.6 T淋巴細胞亞群測定 制備脾組織勻漿2 mL，尼龍布過濾，加入預冷的紅細胞裂解液2 mL，2 min后加入2 mL PBS終止反應，4 000 r·min-1離心2 min，PBS洗滌，2 mL PBS沖懸，取300 μL懸液加入300 μL 5%脫脂奶粉封閉，每個樣品取2份，放入冰盒內搖床搖30 min，2 mL PBS終止反應，離心洗滌2次，分別加入CD3+-PE、CD4+-FITC和CD3+-PE、CD8+-FITC各25 μL，冰盒內避光冰搖30 min，加2 mL PBS終止反應，洗滌，過400目尼龍網。加入PBS調整細胞濃度(約 1×106mL-1)，流式細胞儀檢測脾 T 淋巴細胞亞群。

1.4.7 骨髓嗜多染紅細胞微核數目和DNA含量測定 小鼠頸椎脫臼處死后，取兩側股骨，將肌肉等組織去除剔凈，用生理鹽水洗凈擦干、稱重。取一側股骨剪掉骨頭兩端股骨頭，用生理鹽水沖取骨髓，吹打混勻。1 000 r·min-1離心棄上清液，加入一滴無菌胎牛血清，進行骨髓推片，干燥后放入甲醇溶液中固定5 min，吉姆薩染色按試劑盒說明操作。染色結束立即用 1/15 mol·L-1磷酸鹽緩沖液沖洗。油鏡下計數具有微核(micronuclens, MN) 的嗜多染紅細胞，結果以千分率(‰)表示。將另一側股骨用10 mL CaCl2溶液沖洗骨髓至離心管中，置于4℃環境中30 min。3 500 r·min-1離心15 min，去上清液，向沉淀物中加入5 mL 0.005 mol·L-1HClO4溶液，吹打均勻，95℃水浴加熱15 min后，流水冷卻，2 500 r·min-1離心10 min。測上清液在268 nm處的吸光值，按照以下公式計算DNA系數：

DNA系數=A268 nm/股骨重(g)

1.4.8 抗氧化能力測定 取肝組織在預冷的生理鹽水中制備10%肝組織勻漿，2 500 r·min-1離心10 min取上清液，測定蛋白含量(雙縮脲法)、T-SOD活性(羥胺法)、T-AOC(比色法)及MDA含量(TBA法)。具體方法和結果計算參照相應的試劑盒說明書。

1.5 數據處理與分析

本試驗數據統計及制圖采用GraphPad Prism 8軟件，結果分析采用SPSS 20.0軟件。小鼠多組間單因素差異性采用Dunken新復極差法進行比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 手掌參多糖的提取與檢測結果

如圖1所示，試驗中葡萄糖標準品濃度(x)與吸光度(y)的線性關系良好，關系式可表示為：y=0.014 8x+ 0.018 8，兩變量間相關系數R2=0.999 3。通過測量手掌參多糖溶液的吸光值，代入公式可得到樣品中手掌參多糖含量為89.3%。

圖1 葡萄糖含量標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose content

多糖的紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)分析結果如圖2所示，該多糖具有典型的多糖吸收峰，將提取的手掌參多糖在4 000～400 cm-1的波段內進行紅外光譜掃描，在3 323 cm-1處為O-H的伸縮振動[8]，2 887 cm-1處為CH3、CH2、CH等的C-H伸縮振動[9]； 1 649 cm-1處為酰胺基-CONH2的伸縮振動，1 018、478 cm-1處為吡喃糖環；873 cm-1處為β-吡喃環中C-H的變角振動，807 cm-1處為呋喃環中C-H變角振動吸收峰[10]。由此可知，手掌參多糖是含有吡喃糖和呋喃環的酸性多糖。

圖2 手掌參多糖的紅外光譜分析Fig.2 Infrared spectroscopy analysis of gymnadenia conopsea polysaccharide

2.2 手掌參多糖對小鼠外周血細胞計數和分類的影響

由圖3可知，手掌參多糖對小鼠的血紅蛋白含量影響有限，與空白組相比，手掌參多糖中、高劑量組(300、600 mg·kg-1)對淋巴細胞百分率、紅細胞和白細胞計數有明顯增加作用，特別是對白細胞計數增加效果顯著；小鼠受輻射后，輻射組外周血血紅蛋白含量和紅細胞計數顯著降低，白細胞計數和淋巴細胞百分率顯著降低，與輻射組相比，手掌參多糖輻射給藥組血紅蛋白含量、淋巴細胞百分率、紅細胞和白細胞計數均不同程度增加，中、高劑量組增加顯著(P<0.05)，血紅蛋白含量和紅細胞計數趨于正常水平。表明手掌參多糖可促進輻射后造血系統和免疫系統損傷的修復。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Data with different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖3 手掌參多糖對小鼠外周血的影響Fig.3 Effect of gymnadenia conopsea polysaccharide on peripheral blood of mice

2.3 手掌參多糖對小鼠脾臟指數的影響

由圖4可知，灌胃手掌參多糖可以提高正常小鼠脾臟指數，也可提高輻射后小鼠的脾臟指數，且在一定范圍內與給藥劑量呈正相關。經5 Gy60Co-γ射線輻射后，輻射組小鼠脾臟指數顯著下降，顯著低于空白組(P<0.05)，灌胃手掌參多糖可以提高輻射組小鼠脾臟指數，并恢復至正常水平。本試驗還對小鼠的胸腺進行稱重對比，輻射后胸腺急劇萎縮，解剖后難以尋找和分離，稱重存在較大誤差，故未作統計，但給藥組有不同程度的改善，說明輻射對小鼠的免疫器官有較大的影響，手掌參多糖對小鼠的免疫系統有較好的治療和恢復作用。

圖4 手掌參多糖對小鼠脾臟指數的影響Fig.4 The effect of gymnadenia conopsea polysaccharide on the spleen index of mice

2.4 手掌參多糖對小鼠脾T淋巴細胞亞群的影響

如圖5所示，與空白組相比，不同劑量給藥組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例均不同程度升高，輻射組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例均顯著降低；灌胃手掌參多糖后，300、600 mg·kg-1劑量輻射給藥組的 CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例均顯著高于輻射組(P<0.05)。

圖5 手掌參多糖對小鼠脾臟 T 淋巴細胞亞群的影響Fig.5 Effect of gymnadenia conopsea polysaccharide on mouse spleen T lymphocyte subsets

2.5 手掌參多糖對小鼠骨髓微核數目和DNA含量的影響

由圖6-A可知，手掌參多糖中、高劑量給藥組對正常小鼠微核數目有顯著降低作用，但經5 Gy60Co-γ射線輻射后小鼠微核數目增多，說明輻射造成了小鼠染色體損傷，PCE分裂過程受到影響，從而使微核數目增加[11]； 輻射給藥組微核數目相比輻射組顯著減少(P<0.05)，這可能與手掌參多糖的抗氧化作用有一定關系。

圖6 手掌參多糖對小鼠PEC微核數目(A)和骨髓DNA系數(B)的影響Fig.6 Effect of gymnadenia conopsea polysaccharide on mouse Number of PECmicronuclears (A) and Bone marrow DNA coefficient(B)

如圖6 B，與空白組相比，給藥組正常小鼠骨髓DNA顯著增加，但不隨給藥劑量增加變化；γ射線作用后，小鼠骨髓DNA含量顯著降低；輻射給藥組小鼠骨髓DNA含量不同程度上得到改善，但與空白組有顯著差異(P<0.05)，這表明手掌參多糖對機體DNA有一定保護作用，但本試驗未能使DNA含量恢復至正常水平，需進行進一步探討。

2.6 手掌參多糖對小鼠抗氧化能力的影響

由圖7可知，灌胃手掌參多糖后，低劑量給藥組對正常小鼠T-AOC 能力沒有明顯提升，但中、高劑量給藥組對小鼠的抗氧化能力有顯著提升，同時也使小鼠機體內MDA含量顯著降低，說明手掌參多糖對小鼠機體的抗氧化能力有一定提高作用；5 Gy60Co-γ射線輻射后輻射組小鼠肝臟中T-SOD活性和T-AOC能力顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)，說明小鼠抗氧化能力受到嚴重損害；輻射后手掌參多糖高劑量給藥組小鼠T-SOD活性和T-AOC能力相比輻射組顯著提高，MDA含量也大大降低，且都能恢復至正常水平甚至更優于正常水平，其中T-AOC能力在低劑量給藥組即可得到顯著提高(P<0.05)；雖輻射給藥中、低劑量組T-SOD活性未有明顯改善，但高給藥量組T-SOD活性顯著提高且能恢復到正常水平，T-AOC能力在輻射低給藥量組即可恢復正常水平，表明手掌參多糖可以提高小鼠的抗氧化能力，并對電離輻射產生的抗氧化能力損傷有一定治療作用，保護機體減少氧化損傷。γ射線輻射的小鼠灌胃手掌參多糖后，中、高劑量組MDA水平顯著降低，且可以恢復至正常水平，表明手掌參多糖可清除機體內自由基含量，減輕氧化損傷。

圖7 手掌參多糖對小鼠肝臟超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(A)、總抗氧化能力(T-AOC)(B)、丙二醛(MDA)含量(C)的影響Fig.7 Effects of palm ginseng polysaccharides on superoxide dismutase (T-SOD) activity (A), total antioxidant capacity (T-AOC) (B), malondialdehyde (MDA) content (C) in mice liver

3 討論

科技的快速發展使電離輻射危害得到更多的關注，研究表明電離輻射既可通過能量傳遞直接作用于生物大分子，如DNA螺旋結構改變、染色體畸變等；也可作用于水分子使之發生輻解反應，產生自由基并間接作用于生物大分子，造成輻射損傷，甚至導致細胞死亡[12-13]。Wu等[14]研究表明機體輻射損傷主要集中在分化程度較低的系統，所以輻射對造血系統、免疫系統、遺傳物質和抗氧化能力有較大影響。

機體經電離輻射后造血系統最早出現變化，電離輻射損傷的早期標志之一是外周血象的改變[15-17]。電離輻射可導致細胞的新陳代謝受阻或停滯、染色體畸變及有絲分裂停止等，主要表現為各類血細胞水平下降及造血微循環障礙等，可能是通過抑制或破壞造血干細胞和增殖細胞的增殖能力從而導致造血系統損傷[4,18]。本試驗結果顯示，5 Gy60Co-γ射線輻射后，外周血中淋巴細胞百分率、白細胞計數、輻射組小鼠紅細胞計數和血紅蛋白含量顯著下降，其中淋巴細胞下降幅度最大，耿艷艷等[19]也得到了類似的結果，這可能是電離輻射導致小鼠機體造血系統損傷，進而抑制造血干細胞增殖、分化能力[19-20]。與之相對應的手掌參多糖輻射給藥組，小鼠外周血中各類血細胞水平下降得到緩解，并在一定范圍內與手掌參多糖劑量呈正相關，表明手掌參多糖對輻射造成的造血系統損傷具有一定的治療作用。電離輻射可導致免疫器官萎縮，骨髓、胸腺等造血器官中免疫細胞凋亡、增殖和分裂受阻，進一步造成外周血免疫細胞減少[21-22]。脾臟指數是反映脾臟免疫功能的重要指標，輻射往往能造成脾臟指數的顯著下降，其機制可能是射線輻射導致內質網凋亡途徑下游的促凋亡蛋白的表達不同程度的降低，因此誘導經射線輻射的小鼠脾細胞凋亡[23]。本試驗中，小鼠受5 Gy60Co-γ射線輻射后，脾臟指數急劇下降，外周血中免疫相關細胞水平顯著降低，說明輻射能對機體的免疫系統造成嚴重損傷。另外，本研究發現輻射給藥組小鼠的脾臟指數顯著高于輻射組，高劑量給藥組脾臟指數可以恢復至正常水平，表明手掌參多糖對免疫器官和外周血免疫細胞具有一定的保護作用。T 淋巴細胞是機體內數量最龐大且功能最復雜的免疫活性細胞，因其表面標志物的不同可分為多個亞群[24]。CD3+細胞可與 T 細胞抗原受體結合，傳遞抗原信號至細胞內[25]。CD4+細胞可通過多肽抗原反應被激活，進而分泌白介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon, IFN)等淋巴因子，起輔助協調作用，是免疫應答反應的重要組成[26]。CD8+細胞可通過組織相容復合體與抗原結合，直接殺傷靶細胞[27]。本試驗使用流式細胞儀測定了小鼠脾臟 T 淋巴細胞亞群，結果顯示，γ射線輻射后，小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞比率均顯著降低，說明輻射對 T 淋巴細胞造成損傷。而手掌參多糖可顯著提高受γ射線輻射小鼠 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞比例，表明其可減輕輻射對 CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的影響，這與黑大蒜多糖[22]、靈芝多糖[24]的研究結果相似，多糖可以促進 T 細胞增殖，有助于減輕輻射對T 淋巴細胞的損害。

電離輻射可使機體內水分子發生電離并產生自由基，進一步引發氧化級聯反應造成DNA的損傷，同時還可誘發微核的形成，影響細胞的增殖分化，對機體產生多維度的毒害作用[28]。骨髓DNA含量是反映骨髓造血細胞增殖、分化和成熟的重要指標[29]。小鼠骨髓嗜多染紅細胞中的微核數目是染色體及DNA 受損傷程度的重要標志[30]。本試驗發現，灌胃手掌參多糖可使輻射小鼠PCE微核數量顯著降低，DNA含量顯著增高，說明手掌參多糖對輻射損傷有一定的治療作用，其機理可能是手掌參多糖清除自由基并中斷其引發的鏈式反應，降低輻射對DNA分子的損傷，這可能與手掌參多糖的體內抗氧化活性有關[31]。SOD是一種穩定性高、分布廣泛的特異性酶，可以清除體內超氧陰離子自由基，保護機體免受超氧陰離子自由基損傷，具有抗氧化和抗衰老的作用；T-AOC反映了機體的抗氧化狀態；MDA是一種脂質過氧化物，可反映細胞和組織受自由基損傷的程度[32]。在本試驗中，灌胃手掌參多糖能夠提高正常小鼠體內T-SOD和T-AOC能力，促進輻射損傷小鼠體內T-SOD與T-AOC能力的恢復，其中600 mg·kg-1給藥組的效果較顯著；輻射組MDA水平均顯著增高，灌胃手掌參多糖可降低小鼠肝臟中的MDA含量，其中300、600 mg·kg-1灌胃手掌參多糖組的效果較好。由此可見，手掌參多糖可以提高小鼠機體抗氧化能力，清除電離輻射產生的自由基并阻斷自由基鏈的傳遞從而降低MDA含量，減少SOD的消耗[3]。

本研究僅以600 mg·kg-1為最大給藥劑量進行試驗觀察，更高劑量的手掌參多糖對輻射損傷療效果還需繼續探討，同時手掌參多糖對5 Gy60Co-γ 射線輻射損傷小鼠具有一定的治療作用，但對于不同程度的輻射損傷，所需手掌參多糖的最佳用量有待進一步研究。在此基礎上將繼續深入分析精確輻射劑量區間，以及緩解不同程度輻射損傷的最佳給藥劑量區間，并深入探究手掌參多糖緩解輻射損傷的具體機理。

4 結論

本試驗表明，灌胃不同劑量的手掌參多糖可以不同程度地提高小鼠外周血白細胞計數、紅細胞計數、淋巴細胞百分比和血紅蛋白含量的水平，改善脾臟、骨髓輻射損傷，減輕細胞膜脂損傷，提高 T-SOD活性和T-AOC能力，減少MDA 的產生，提高輻射小鼠T淋巴細胞比例。綜上，手掌參多糖可以提高小鼠的體內抗氧化能力、免疫力及造血能力，并對60Co-γ射線輻射造成的小鼠造血、抗氧化功能損傷具有治療作用。