不同品質冰糖橙果園土壤化學性質與微生物群落差異分析

徐紹英 彭 雙 林先貴 王一明,* 戴 勛 褚躍革 黃學彩

(1 中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；2 中國科學院大學，北京 101400；3 紅塔煙草(集團)有限責任公司，云南 玉溪 653100；4 云南省玉溪市高原甜橙有限責任公司，云南 玉溪 653100)

冰糖橙(Citrussinensis)屬于蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)常綠喬木，是從普通甜橙的優良實生變異中選出的地方良種[1]。該品種因品質優良、味濃香甜、肉質脆嫩等特性而倍受市場歡迎。云南是我國冰糖橙的主要產地之一，種植面積達6 700 hm2[2]。冰糖橙的產量和品質受多種自然因素的影響，包括土壤、氣候、地形地貌、水文等，其中土壤是柑橘生產的基礎，土壤養分和肥力狀況直接影響柑橘的產量和品質[3]。研究表明，土壤有機質與甜橙果實品質、還原糖、可溶性固形物含量呈顯著線性正相關，水解性氮與果實糖酸比、固酸比含量呈顯著線性正相關[4]；土壤速效鉀、有效硼和pH可顯著影響冰糖橙果實的可滴定酸含量；土壤有機質、有效磷、交換性鎂和pH可顯著影響維生素C的含量[3]。

微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，是土壤化學過程的主要推動者[5]，也是土壤肥力形成和持續發展的基礎[6]。土壤中一些微生物群落可以促進植物對土壤氮、磷養分的吸收[7]，菌根群落可以增加土壤磷的轉化以及磷對植物的可吸收性[8]。果園土壤微生物對土壤養分轉化、植物生長及健康至關重要，研究表明根際促生菌具有促進磷酸鹽溶解、固氮、產生生長素等功能[9]，一些菌群還可以誘導柑橘對病原體產生抗性[10]。土壤微生物可以通過多種方式影響土壤肥力和植株生長狀況，而土壤養分狀況和植物生物量以及健康狀況又反過來影響著土壤微生物群落的結構和功能[11-12]。因此，除了土壤化學性質外，植物的物種特性和生命力等性狀對根際土壤微生物群落也有相當大的影響。充分了解植物性狀-土壤化學性質-土壤微生物三者之間的相互關系和綜合作用，對于更好地指導農事管理和農業施肥措施具有重要意義。

坡地果園容易受到土壤侵蝕和養分流失的影響，因此土壤肥力對于保持水果的產量和品質非常重要。然而，坡地果園開墾對土壤質量，尤其是果園土壤發育過程中土壤微生物特性的影響，目前尚不清楚。本研究以云南哀牢山產區不同品質冰糖橙果園土壤為研究對象，在土壤類型、海拔、農事管理和樹齡(10 年以上)均相同的情況下，對比不同品質冰糖橙果園土壤化學性質和微生物群落的差異，分析導致冰糖橙品質發生變異的因素，探討冰糖橙地上變異與地下土壤化學性質和微生物群落之間的因果關系，旨在為冰糖橙果園栽培管理、微環境調節以及土壤狀況的評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 采樣地點信息

采樣地點位于云南省玉溪市高原甜橙有限責任公司新平哀牢山基地，海拔700～900 m，土壤類型為紅砂巖發育的濕潤富鐵土(Udic Ferrosols)。橙園果樹品種為冰糖橙，樹齡10 年以上，平均每棵樹產果30 kg。果園每年施肥2次，分別在每年的5月和12月施肥，夏肥(5月)施用量：每棵樹施用鈣鎂磷肥0.8 kg(含五氧化二磷16%)，尿素0.4 kg(含氮46%)，硫酸鉀0.6 kg(氧化鉀含量50%)。冬肥(12月)施用量：每棵樹施用鈣鎂磷肥0.8 kg(含五氧化二磷16%)，尿素0.4 kg，農家肥30 kg。施肥方式為放射狀溝施，溝深30～40 cm，施入肥料后覆蓋土壤。該果園經過十多年管理和栽培，部分冰糖橙產出的果實糖度較高，并帶有蜂蜜味，品質較其他橙樹的果實好，因此將橙園中的果樹劃分為兩類，即高品質冰糖橙(記為H)和普通冰糖橙(記為N)。2019 年9月對橙子品質進行分析，數據如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品采集 土壤樣品采于2019 年7月，對兩組橙子樹根圍0～20 cm土層(記為a)和20～30 cm土層(記為b)分別進行采樣，每組樣本設置3個重復。土壤樣品采集方式為五點取樣法，每個樣點在橙子樹的滴水線(距離橙子樹主干30～50 cm)內，用無菌鏟采集土壤樣品，去除雜質后混勻，一部分風干用于測定土壤化學性質，另一部分置于-20℃冰箱中保存用于DNA提取。

表1 不同品質冰糖橙果實的品質差異Table 1 Quality of Bingtang orange fruits with different quality

1.2.2 土壤化學性質和微量元素含量的測定 土壤化學性質與微量元素測定的指標：pH值(水土比為2.5∶1)、有機質(organic matter，OM)、水溶性碳(water soluble carbon，WSC)、全氮(total nitrogen，TN)、全磷(total phosphorus，TP)、全鉀(total potassium，TK)、水解性氮(hydrolyzed nitrogen，HN)、有效磷(available phosphorus，AP)、速效鉀(readily available potassium，RAK)、緩效鉀(slowly available potassium，SAK)、交換性鈣(exchangeable calcium，ECa)、交換性鎂(exchangeable magnesium，EMg)、有效銅(available copper，ACu)、有效鋅(available zinc，AZn)、有效錳(available manganese，AMn)、有效鐵(available iron，AFe)、有效硼(available boron，AB)、有效鉬(available molybdenum，AMo)和有效硅(available silicon，ASi)，均由云南三標農林科技有限公司采用常規方法完成，具體參見《土壤農化分析》[13]。

1.2.3 土壤DNA提取、擴增和測序 每個樣品稱取0.5 g鮮土(各土樣含水量在12%～16%之間，差異不大)，利用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)提取土壤總DNA，步驟參照試劑盒說明，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，于-20℃冰箱保存備用。依托北京諾禾致源公司的IonS5TMXL平臺，采用單端 (Single-end) 測序的方法，對各處理土壤DNA的真菌內轉錄間隔區(ITS)的ITS1區和細菌16S rRNA基因的V4區進行擴增測序。

通過Cutadapt軟件對Reads進行過濾，按Barcode拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。用Uparse軟件對序列進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。根據OTU聚類結果，細菌和真菌分類分別對應于SILVA132數據庫和Unit(v7.2)數據庫，對每個OTU的代表序列做物種注釋，設定閾值為0.8～1，獲得各個分類水平下的物種豐度信息。利用QIIME 1.9.1軟件計算Alpha多樣性指數(Chao1指數、ACE指數、Simpson指數和Shannon指數)。

1.3 數據統計與分析

運用SPSS 13.0軟件進行統計分析，并使用獨立樣本T檢驗比較同一土層的兩組土壤化學性質是否具有顯著差異(P<0.05)。使用Wilcox檢驗進行組間Alpha多樣性指數的差異顯著性分析；使用R軟件的pheatmap軟件包對屬水平上細菌和真菌優勢群落相對豐度進行聚類分析并繪制熱圖；用Vegan軟件包進行NMDS分析和Adonis、ANOSIM檢驗，分析微生物群落結構并對其進行差異顯著性檢驗。通過組間T檢驗，找出豐度差異顯著(P<0.05)的物種。利用R軟件中的Plspm軟件包分析土壤化學性質、微量元素含量、細菌群落結構、真菌群落組成和橙子品質之間的關系；GoF作為整個模型的平均預測指標，GoF值越高越好，在偏最小二乘路徑建模(partial least squares path modeling，PLS-PM)中，GoF值大于0.7被認為模型非常好。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

不同品質冰糖橙根圍土壤中的化學性質和微量元素含量如表2所示，與普通品質冰糖橙0～20 cm土層土壤(Na)相比，高品質冰糖橙土壤(Ha)中有機質含量顯著提高(P<0.01)，交換性鈣、交換性鎂的含量顯著提高(P<0.05)，全鉀含量顯著升高(P<0.001)，分別提高了30.22%、26.23%、43.56%、84.31%，有效錳含量降低了67.16%(P<0.05)；在20～30 cm土層，高品質冰糖橙根圍土壤(Hb)中全磷、全氮和全鉀的含量分別在P<0.05、P<0.01、P<0.01水平顯著升高，與Nb相比分別升高了81.48%、73.24%、69.15%，有效錳含量降低了57.6%(P<0.01)。

表2 不同品質冰糖橙根圍土壤化學性質及其差異Table 2 Chemical property and differences of soil samples near the root zone of different quality Bingtang orange

2.2 土壤微生物群落多樣性

細菌和真菌群落的α多樣性指數及其Wilcox檢驗結果如圖1所示，不同品質冰糖橙根圍土壤微生物群落多樣性指數無顯著差異，僅普通品質冰糖橙根圍土壤的不同土層之間，細菌群落的Shannon指數和ACE指數存在顯著差異，真菌群落的Chao 1指數存在顯著差異。對細菌和真菌群落進行NMDS分析，并對組間群落結構差異進行ANOSIM顯著性檢驗，結果表明不同品質冰糖橙根圍土壤微生物群落結構也無顯著差異(P>0.05，圖2)。

注：*表示在P<0.05水平差異顯著。Note:*indicates significant difference at 0.05 level.圖1 土壤細菌群落(a)和真菌群落(b)的α多樣性指數Fig.1 Alpha diversity index of soil bacterial community (a) and fungal community (b)

注：ANOSIM分析中R值介于-1～1之間，R大于0，說明組間存在差異，R小于0，說明組間沒有差異，P< 0.05表示統計具有顯著性。Adonis分析中的R2表示不同分組對樣本差異的解釋度，即分組方差與總方差的比值，R2越大表示分組對差異的解釋度越高， P<0.05說明檢驗的可信度高。Note: The R value in the ANOSIM analysis is between (-1, 1), R is greater than 0, indicating that there is a difference between groups, R is less than 0, indicating that there is no difference between groups, P<0.05 indicates statistical significance. The R2 in the Adonis analysis indicates the degree of interpretation of sample differences between different groups, that is, the ratio of the group variance to the total variance. The larger R2indicates the higher the degree of explanation of the difference between the groups, P<0.05 indicates the higher reliability of the test.圖2 不同品質冰糖橙果園土壤細菌(a)、真菌(b)群落結構NMDS分析Fig.2 Nonmetric Multidimensional Scaling analysis of bacterial (a) and fungus (b) community structure in different quality Bingtang orange orchards soil

2.3 土壤微生物組成

土壤細菌群落組成如圖3所示，主要的細菌優勢菌門(圖3-a)為放線菌門(Actinobacteria，31.90%～41.33%)、變形菌門(Proteobacteria，21.21%～32.92%)、綠彎菌門(Chloroflexi，7.69%～12.69%)和酸桿菌門(Acidobacteria， 7.35%～12.58%)。對36個優勢細菌種屬進行分析，發現土壤中的優勢細菌種屬豐度存在明顯差異(圖3-b)，聚類分析發現Ha與Na聚在一個分支，說明土層深度對細菌群落的影響大于分組差異。通過T檢驗，找出組間相對豐度具有顯著性差異的菌群，結果如圖3-c、d所示，與Na相比，綠彎菌門(Chloroflexi)和藍細菌門(Cyanobacteria)在Ha土壤中顯著富集，擬桿菌門(Bacteroidetes)則顯著減少；Hb土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度顯著低于Nb土壤(圖3-d)。在科水平上，與Na相比，纖線桿菌科(Ktedonobacteraceae)和綠彎菌未鑒定科(unidentified_Chloroflexi)在Ha土壤中顯著富集(圖3-c)。

土壤真菌群落組成如圖4-a所示，優勢真菌類群為子囊菌門，占比61.4%～79.9%，其次為擔子菌門，占比1.5%～3.2%。優勢真菌種屬存在明顯的差異(圖4-b)，聚類分析發現Ha與Hb聚在一個分支，說明土層深度對真菌群落的影響小于分組差異。通過T-test檢驗發現，Ha與Na，Hb與Nb之間，各真菌類群在門水平上均無顯著差異，在科水平上，叢赤殼科(Nectriaceae)(Ha 31.27%，Na 16.11%)、枝孢菌科(Cladosporiaceae)和葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)在Ha土壤中顯著富集(圖4-c)；Hb與Nb相比，科水平上各真菌類群相對豐度無顯著差異。

注：a：門水平土壤真菌種群的物種豐度；b：屬水平優勢真菌類群的豐度熱圖；c：科水平上組間差異物種。Note: a: Relative abundance of soil fungal phylum. b: Clustered heat map for the relative abundance of the dominant fungal genus. c: Different fungal families between groups.圖4 土壤真菌群落物種組成及組間差異物種Fig.4 Species composition of soil fungal community and the different species between groups

2.4 土壤化學性質、微生物群落與冰糖橙品質的關系

將土壤化學性質、土壤微量元素含量、微生物群落結構與橙果實品質進行PLS-PM分析，結果如圖5所示。土壤化學性質和微生物群落結構對橙果實品質產生了直接正影響，土壤微量元素含量對橙果實品質均產生了負影響，但影響均未達到顯著水平，其中對橙果實品質產生直接影響最大的是土壤化學性質(主要是TK、TN和OM)，直接影響系數達到了0.961(圖5-a)。由圖5-b可知，對橙果實品質的總影響(包括直接和間接影響)較大的是土壤化學性質(0.563)和微量元素(-0.761)；土壤中的細菌和真菌群落結構對橙子品質的總影響分別為0.242和0.361，均小于土壤化學性質和微量元素的影響。

3 討論

3.1 土壤養分及微量元素是影響橙果實品質的主要因素

研究表明，冰糖橙果實中可溶性固形物含量主要受土壤有機質、有效銅、有效鋅含量和pH值的影響，可滴定酸含量主要受土壤速效鉀、有效硼含量和pH值的影響[3]。Peng等[14]發現柑橘根系土壤鎂元素的缺乏會抑制葉片的光合作用，適量增施鈣[15]、鎂肥[16]可提高柑橘果汁的維生素C、可滴定酸、可溶性固形物含量以及固酸比。此外，官雪芳等[4]研究表明土壤有機質與甜橙果實品質、還原糖、可溶性固形物呈顯著線性正相關。本研究中，高品質冰糖橙根圍土壤中的有機質、全磷、全鉀、交換型鈣鎂含量顯著高于普通冰糖橙根圍土壤(表1)，與前人對橙子樹根圍土壤的研究結論一致，說明土壤養分會影響冰糖橙的品質。此外，PLS-PM分析結果也驗證了這一推測，土壤化學性質、土壤微量元素含量、微生物群落結構等因素中，對橙果實品質影響較大的是土壤化學性質(主要是TK、TN和OM)和微量元素(主要是EMg)，細菌和真菌群落結構對橙果實品質的影響相對較小(圖5)。由此推測，通過合理施肥維持土壤養分及有機質含量水平，并及時調節微量元素使其處于合理水平是橙園土壤管理的關鍵。

3.2 土壤微生物及其與橙果實品質的關系

注：偏最小二乘路徑建模(PLS-PM)分析了主要土壤化學性質、主要微量元素、微生物群落結構影響橙子品質的路徑、直接影響系數，及直接影響和間接影響的標準化總效應。主要土壤化學性質(pH、OM、TN、TP、TK、RAK)和主要微量元素(ECa、EMg、ACu、AZn)通過PLS-PM分析篩選得出，微生物群落結構為細菌和真菌PCoA的第一軸。路徑系數(即直接效應)用箭頭表示，**表示路徑系數達到顯著(P<0.01)，帶有正負系數的箭頭分別用紅色和藍色表示，R2值表示由內部模型不同因變量解釋的方差，GOF表示 模型擬合優度指標。Note: Partial Least Squares Path Modeling (PLS-PM) analyzes the path of the main soil chemical properties, main trace elements, microbial community structure affecting orange quality, the direct impact coefficient, and the standardized total effect of the direct and indirect effects. The main soil chemical properties (pH, OM, TN, TP, TK, RAK) and the main trace elements (ECa, EMg, ACu, AZn) are selected through PLS-PM analysis, and microbial community structure are the first PCoA axis of bacterial and fungal communities. Path coefficients (i.e., direct effects) are displayed on arrows, and ** means that the path coefficient reaches significant (P < 0.01). Arrows with positive and negative coefficients are shown in red and blue, respectively. R2values represent the variance of dependent variables explained by the inner modal. GOF denotes the goodness of fit index.圖5 偏最小二乘路徑建模分析Fig.5 Partial least-squares path modelling (PLS-PM)

本研究中，兩種品質的冰糖橙根圍土壤中，細菌和真菌群落結構和多樣性無顯著差異(圖1、2)。土壤微生物群落結構和多樣性受多種因素影響，外因包括氣候條件、植被類型、土壤類型和人類活動等，內因主要是與土壤微生物生長密切相關的土壤性質及養分含量等化學因素[17]。本研究中，兩種品質的橙果實根圍土壤類型、農事管理、所處地理位置以及橙品種及其種植年限均相同，可能對其產生影響的只有土壤內部因素，即土壤化學性質。雖然已有研究表明土壤化學性質會對土壤微生物群落產生影響，例如長期施用糞肥可通過改變土壤環境(如pH值)來影響土壤微生物群落結構[18]，土壤有效磷、全磷含量和pH顯著影響了土壤微生物的物種多樣性[19]。但這種影響會因地域氣候差異、土壤類型差異以及農事管理的不同而不同，如Wang等[20]發現水稻和小麥根際土壤在不同施肥條件和作物的不同發育時期，土壤化學性質發生了明顯改變，使得根際土壤微生物群落結構也發生明顯改變，但是多樣性的總水平保持穩定；劉思等[21]發現葡萄枝條覆蓋的土壤中，土壤pH值、有機質含量和速效磷含量可以顯著影響優勢群落的相對豐度；Ding等[22]研究表明土壤真菌群落主要受土壤速效磷和有機質含量的影響，其次是土壤pH值；而Han等[23]研究表明土壤氮是影響真菌群落的主要因素。雖然不同品質冰糖橙根圍土壤中部分化學因子(如0～20 cm土層土壤中的有機質、全鉀、交換性鈣、交換性鎂等)存在顯著差異(表1)，但因外部因素基本一致，土壤內部化學性質的差異不足以引起微生物多樣性和群落結構發生顯著改變。

土壤微生物不僅是土壤的重要組成部分，也是土壤養分循環的主要驅動力[24]。土壤微生物可提高土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質等的含量，可促進植物對P、Zn、Cu等元素的吸收[5]，但是這種促進作用并不一定以土壤微生物群落結構發生改變為前提。本研究中，雖然兩種品質冰糖橙根圍土壤微生物多樣性和結構沒有顯著差異，但是部分細菌類群或真菌類群在高品質冰糖橙根圍土壤中顯著富集，如綠彎菌門(Chloroflexi)、藍細菌門(Cyanobacteria)和纖線桿菌科(Ktedonobacteraceae)等細菌類群與叢赤殼科(Nectriaceae)、枝孢菌科(Cladosporiaceae)和葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)等真菌類群(圖3～4)。綠彎菌門包括光營養型和非光營養型，還可分為自養、異養和混合營養類群，在富營養條件下可以利用簡單有機物進行光能異養生長，促進土壤C、N、S等元素循環，提高土壤中的養分含量[25]。纖線桿菌科是綠彎菌門中的一個分支，現已知的纖線桿菌(Ktedonobacteria)均為革蘭氏陽性需氧菌[26]。研究表明纖線桿菌科(Ktedonobacteraceae)是秦嶺油松根際土壤微生物群落的核心類群，可能在維持根際土壤細菌群落結構和功能方面發揮重要作用[27]。藍細菌門中有許多類群具有固氮功能，可替代部分尿素減少氮的損失并維持水稻產量[28]。真菌叢赤殼科(Nectriaceae)中有許多類群是植物和人類病原體，但也有一些類群廣泛用作生物降解劑和生物防治劑[29]；枝孢菌科(Cladosporiaceae)能夠在鹽堿地土壤中維持較高的相對豐度，具有較強的養分和水分吸收能力[30]；葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)中多種類群是動植物的致病菌，然而，其中一些種屬也可產生有益的次生代謝物質，具有很大的開發價值[31]。上述被富集的細菌和真菌類群均具有一定的養分循環能力或產生次生代謝產物的能力，可能在土壤養分循環過程中發揮重要作用。

已有研究表明，土壤微生物與水果果實品質具有一定的相關性。如吳倩[32]發現湖南各產區橘園土壤細菌、真菌與樹體營養以及果實品質呈顯著正相關；官雪芳等[4]發現少數革蘭氏陰性菌和好氧指示細菌的脂肪酸標記及生態指數與甜橙果實糖酸比、固酸比存在顯著正相關關系；Chai等[33]發現蘋果園土壤放線菌與其果實可滴定酸含量呈正相關；也有研究表明接種叢枝菌根真菌和根際促生菌可以增加草莓果實糖分、芳香化合物、營養元素的濃度[34]。土壤物理化學性質及根系分泌物可以影響土壤微生物群落，真菌和細菌群落共同在土壤物質的代謝、有機質的分解、養分的轉化和循環、平衡土壤養分供應等過程中發揮作用，為植物生長提供營養物質，進而影響果實品質。本研究中，土壤真菌和細菌群落對橙子品質存在直接影響和間接影響(圖5)，這種影響可能是由于在各種理化因素的長期作用下，微生物群落形成了一種平衡且穩定的相互關系，它們共同在土壤物質循環過程中發揮作用。微生物是土壤中最活躍的組成，在維系陸地生態系統地上-地下相互作用，支撐陸地生態系統碳、氮元素循環的過程中發揮著不可替代的作用[35]。但如何通過平衡施肥，在供給植物營養的同時，調控土壤微生物發揮作用，使土壤-植物-微生物良性互作，促進植物生長，提高果實品質，還需要進一步深入研究。

4 結論

不同品質冰糖橙果園土壤化學性質存在顯著差異，高品質冰糖橙根圍土壤中的有機質、全磷、全鉀、交換型鈣鎂含量顯著高于普通冰糖橙。不同品質冰糖橙果園土壤細菌和真菌群落多樣性和組成結構沒有顯著差異，但少數細菌和真菌類群的豐度發生了變化，其對冰糖品質的影響尚不明確。PLS-PM分析表明，對橙果實品質影響較大的是土壤化學性質(主要是TK、TN和OM)和土壤微量元素(主要是EMg)，土壤中的細菌和真菌群落結構對橙子品質的影響相對較小。