基于網絡藥理學探討川芎嗪對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護機制

陳杰 黃石飛 韓業紅

1杭州市中醫院外一科，杭州 310021；2浙江省人民醫院急診醫學科，杭州 310014

川芎嗪(tetramethylpyrazine)是從傳統中草藥川芎中分離得到的化合物，具有血管生成和血管保護作用以及抗炎、抗氧化等功能，臨床上被長期用于治療心腦血管疾病和炎癥性疾病[1]。近來發現川芎嗪可以改善AP引起的胰腺和腸道損傷[2]，通過抑制NF-κB的活化，阻斷炎癥因子釋放和增加細胞凋亡來減輕AP的嚴重程度[3]，具有治療AP的潛能，但確切機制尚未明確。本研究借助于網絡藥理學篩選出川芎嗪治療急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)的靶點，進行功能富集分析和通路富集分析，探討川芎嗪治療ANP的核心靶點及其潛在的分子機制，并進一步在ANP大鼠模型上進行初步驗證，以期為川芎嗪的基礎研究和臨床應用提供新的思路。

材料與方法

一、川芎嗪作用靶點的獲取

利用中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)，以“2,3,5,6-tetramethylpyrazine”為關鍵詞檢索川芎嗪的作用靶點，下載其mol2 格式并上傳到PharmMapper網站。靶點種類設定為Human Protein Targets Only (v2010, 2241)。利用Uniprot數據庫對獲得的靶點進行篩選，物種限定為“homosapiens”。

二、ANP相關靶點的獲取

通過人類疾病信息相關數據庫CTD(Comparative Toxicogenomics Database)、DisGeNET、GeneCards(The Human Gene Database)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)，以“pancreatitis, acute necrotizing”為檢索詞對ANP相關基因進行檢索篩查并整合，剔除重復項，獲得ANP相關的候選靶點。

三、川芎嗪和ANP交集靶點蛋白質相互作用網絡的構建及關鍵靶點篩選

將川芎嗪的作用靶點與ANP的候選靶點上傳至在線韋恩圖，得到川芎嗪和ANP的交集基因。將交集基因導入STRING(Search Tool for Retrieval of Interaction Genes)數據庫以構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction networks, PPI)網絡，將構建的PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件，應用Network Analyzer插件進一步分析、調整后作圖，并利用cytoHubba插件篩選PPI的關鍵靶點。

四、功能富集分析

利用R語言(4.0.3)clusterProfiler包(3.16.1)進行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。參數選擇pvalueCutoff=0.05，pAdjustMethod=“BH”，qvalueCutoff=0.05。GO功能富集分析包括3個不同的水平：生物學過程，細胞組成和分子功能，根據P值從小到大選擇前10位。

五、川芎嗪與ANP關鍵靶點分子對接

將已知的關鍵靶點與川芎嗪進行分子對接，得到對接親和力，反映其穩定性。從蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank, PDB)下載核心蛋白分子結構，從TCMSP下載川芎嗪的結構，將蛋白和川芎嗪結構導入PyMol 2.5.2和Auto Dock Tools 1.5.6軟件進行分子對接及可視化處理。

六、實驗動物及分組

30只250～350 g相同遺傳背景的SPF級雄性SD大鼠均購自上海斯拉克公司，動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005，按照數字表法隨機分為對照組、ANP組和川芎嗪治療組(川芎嗪組)，每組10只。采用胰膽管逆行注射4%牛磺膽酸鈉1 ml/kg的方法建立ANP大鼠模型[4-5]。川芎嗪組在制模后5 min內經腹腔注射川芎嗪注射液10 ml/kg[6]。注射用鹽酸川芎嗪購自平光制藥股份有限公司，溶于100 ml 0.9%生理鹽水，藥物濃度為0.6%。對照組僅經尾靜脈注射等容積PBS。

七、胰腺組織病理學檢查及關鍵靶點蛋白表達檢測

大鼠于制模后12 h處死，取胰腺組織，常規固定，石蠟包埋，切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學改變。應用免疫組織化學染色檢測胰腺組織表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、胱天蛋白酶3(caspase 3, CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)、B細胞淋巴瘤樣蛋白1(B-cell lymphoma-2-like protein 1, BCL2L1/Bcl-XL)蛋白的表達。抗EGFR抗體(ab52894)、CASP3抗體(ab184787)、MAPK1抗體(ab109282)和BCL2L1抗體(ab32370)均購自英國ABCAM公司，二抗(PV-6001)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統獲取染色結果的光密度值。

八、血清生物化學指標檢測

大鼠處死前眼眶取血，2 000 r/min離心(離心半徑9.856 cm)收集血清，-80℃保存。采用ELISA法檢測血清白介素-6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。IL-6、TNF-α試劑盒均購自上海江萊生物公司，按試劑盒說明書操作。

九、統計學處理

結 果

一、川芎嗪和ANP的相關靶點

通過TCMSP、PharmMapper數據庫最終得到川芎嗪的潛在靶點共142個，將靶點名稱上傳到Uniprot數據庫，校正靶點名稱并剔除重復基因，最終得到137個靶點。

從CTD、DisGeNET、GeneCards和OMIM數據庫分別篩選出ANP相關基因24 575、62、1 876和150個，合計26 663個；剔除其中關聯得分較小的基因，分別篩選出202、62、234和69個相關度得分較高的基因，經合并剔除重復基因后得到513個高分靶點。

二、川芎嗪和ANP交集靶點基因及PPI網絡構建

將川芎嗪潛在靶點信息與ANP高分靶點信息取交集，選擇同時存在于川芎嗪潛在靶點信息與ANP高分靶點信息中的靶點基因，得到川芎嗪中與ANP發病機制相關的25個作用靶點基因(圖1)。通過STRING數據庫構建了川芎嗪和ANP交集的25個作用靶點的PPI網絡，發現其中5個關鍵靶點有相互作用，分別為白蛋白(ALB)、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1，節點度(degree)值分別為21、18、16、15、14。

圖1 川芎嗪與急性壞死性胰腺炎的共同靶點

三、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對25個共同靶點基因進行GO功能分析，結果顯示，生物學過程主要涉及生殖結構發育(GO：0048608)、生殖系統發育(GO：0061458)、對抗生素的反應(GO：0046677)、細胞對化學應激的反應(GO：0062197)和對活性氧的反應(GO：0000302)等；細胞組成主要為囊泡腔(GO：0031983)、膜筏(GO：0045121)、膜微區(GO：0098857)、分泌顆粒腔(GO：0034774)和細胞質囊泡腔(GO：0060205)等靶蛋白；分子功能主要包括SH2域結合(GO：0042169)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO：0004713)、磷酸酪氨酸殘基結合(GO：0001784)、蛋白酶結合(GO：0002020)和核受體活性(GO：0004879)等。

對25個共同靶點基因行KEGG通路富集分析，結果顯示，與ANP的發展和治療相關的通路主要包括Ras信號通路(hsa04014)、PI3K-Akt信號通路(hsa04151)、鉑類藥物耐藥(hsa01524)、磷脂酶D信號通路(hsa04072)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(hsa01521)，以及慢性粒細胞白血病、膀胱癌和黑色素瘤等腫瘤信號通路。

四、川芎嗪與ANP關鍵靶點分子對接

運用AutoDockTools以半柔性對接方法將川芎嗪與上述關鍵靶點進行分子對接，得到川芎嗪與ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1的結合能分別為-5.06、-4.03、-3.74、-3.82、-4.33 kcal/mol，平均結合能為-4.20 kcal/mol。它們之間分子對接的詳細模式見圖2。

圖2 川芎嗪與白蛋白(2A)、表皮生長因子受體(2B)、胱天蛋白酶3(2C)、絲裂原活化蛋白激酶1(2D)、B細胞淋巴瘤樣蛋白1(2E)的分子對接模式圖

五、各組大鼠胰腺組織病理學改變

對照組大鼠無腹水，胰腺形態正常，鏡下見胰腺小葉結構完整。ANP組大鼠腹腔內有大量血性腹水，胰腺、腸系膜周圍可見散在的鈣化斑，胰腺腫脹、周圍滲出明顯，并可見出血壞死灶；鏡下見胰腺腺體結構較紊亂，小葉間隙明顯增大，腺泡、血管周圍以及腺體間隙均可見中性粒細胞浸潤。川芎嗪組大鼠腹腔內少量腹水，胰腺輕中度腫脹伴周圍少量滲出，鏡下見胰腺小葉間隙略微增大，散在中性粒細胞浸潤(圖3)。

圖3 對照組(3A)、急性壞死性胰腺炎組(3B)、川芎嗪組(3C)大鼠胰腺組織病理學改變(蘇木精-伊紅染色 ×200)

六、各組大鼠胰腺組織EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1蛋白表達水平

對照組胰腺組織EGFR、CASP3、MAPK1表達量分別為0.11±0.03、0.20±0.03、0.16±0.03；ANP組分別為0.31±0.04、0.43±0.05、0.33±0.08；川芎嗪組分別為0.24±0.05、0.34±0.06、0.20±0.05。ANP組較對照組顯著升高，川芎嗪組較ANP組顯著降低(P值均<0.01)；對照組、ANP組和川芎嗪組胰腺組織BCL2L1表達量分別為0.19±0.05、0.28±0.06和0.43±0.20，ANP組較對照組顯著升高，川芎嗪組又較ANP組顯著升高(P值均<0.05，圖4)。

圖4 對照組、急性壞死性胰腺炎組、川芎嗪組胰腺組織表皮生長因子受體(4A～4C)、胱天蛋白酶3(4D～4F)、絲裂原活化蛋白激酶1(4G～4I)、B細胞淋巴瘤樣蛋白1(4J～4L)的蛋白表達(免疫組織化學染色 ×20)

七、各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平

ANP組大鼠血清IL-6和TNF-α水平均較對照組顯著增高，而川芎嗪組血清IL-6和TNF-α水平均較ANP組顯著降低，差異均有統計學意義(表2)。

表2 3組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平

討 論

氣不通是AP的基本病機，通里攻下應貫穿治療的始終，在疏肝解郁、清熱化濕、通腑瀉熱、祛瘀通腑、回陽救逆的基本治療原則下，可采用中藥口服、灌腸、外敷和針刺等內外治法相結合的多途徑治療方案[7]。川芎嗪是從傳統中草藥川芎中分離得到的化合物。本研究共獲得25個川芎嗪治療ANP的靶點，其中ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1為治療的核心靶點。一般認為配受體間相互作用的親和力越強，所需的能量就越少，其發生作用的可能性就越大。本研究分子對接的平均結合能為-4.20 kcal/mol，表明川芎嗪與這些關鍵靶點蛋白均有較好的結合活性。同時，GO功能富集分析顯示，川芎嗪治療ANP的生物學過程涉及生殖結構及系統發育、對抗生素的反應、細胞對化學應激的反應和對活性氧的反應等；KEGG通路富集分析結果表明，川芎嗪治療ANP的主要通路富集在Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、鉑類藥物耐藥、磷脂酶D信號通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。

MAPK1又稱細胞外信號調節激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2, ERK2)，作為多種生物化學信號的整合點，參與多種細胞的增殖、分化、轉錄調控和發育等過程。有研究表明，MAPK信號通路與重癥急性胰腺炎的炎癥反應和氧化應激損傷密切相關，通過抑制MAPK信號通路減少腸道炎癥反應和菌群失調，可減輕胰腺組織損傷[8]。本研究結果顯示，MAPK1蛋白在ANP組大鼠中高表達，與對照組比較差異有統計學意義，而川芎嗪組MAPK1表達則較ANP組顯著降低，血清IL-6和TNF-α也顯著降低，說明川芎嗪可以抑制MAPK1的表達及下游信號轉導，減少IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，從而減輕ANP后的炎癥反應和氧化應激損傷。

EGFR是ErbB受體家族的成員之一，屬于受體酪氨酸激酶類。ErbB受體信號通過Akt、MAPK以及其他多種通路來調節細胞增殖、遷移、分化和凋亡。在多種類型的惡性腫瘤中，ErbB家族成員及其部分配體通常過表達、擴增或突變，這使其成為重要的治療靶標[9]。ANP小鼠存在著EGFR信號的過度激活[10]，Fan等[11]研究也發現EGFR可能在AP的發病機制中發揮著重要作用，可作為AP診斷和治療的潛在生物標志物。EGFR配體β細胞素已被證實對AP小鼠有保護作用，雨蛙素和L-精氨酸不能誘導過表達β細胞素的轉基因小鼠引發AP[12]。本研究發現對照組大鼠EGFR蛋白表達水平最低，ANP組表達水平最高，差異有統計學意義，經過川芎嗪干預后，EGFR表達水平則較ANP組明顯降低，推測川芎嗪具有類似β細胞素的作用，能夠促進胰腺β細胞新生，在胰腺再生中發揮一定的作用，對ANP具有保護性作用，可作為治療AP的常規藥物。

細胞凋亡參與AP感染性并發癥的發生和進展，與ANP多器官功能障礙有關，因而，控制細胞凋亡可能是改善ANP臨床預后的有效策略[13]。CASP3是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡半胱天冬酶級聯反應的執行階段起著核心作用，參與細胞凋亡、細胞壞死和炎癥的信號通路[14]。BCL2L1/Bcl-XL則是Bcl-2家族的一種抗凋亡蛋白，是細胞凋亡的關鍵調節因子之一[15]。Loo等[16]在研究人類多能干細胞分化為胰腺細胞的過程中觀察到Bcl-XL的表達上調及caspase 3的相應下調，調節Bcl-XL的表達水平可以顯著改善胰腺細胞的存活率和穩定性。本研究發現ANP組大鼠CASP3蛋白表達水平較對照組顯著升高，經川芎嗪治療后，其表達水平則較ANP組顯著降低；而BCL2L1蛋白表達水平在經過川芎嗪治療后進一步顯著升高，說明川芎嗪可以促進抗凋亡蛋白Bcl-XL表達增多，抑制caspase 3的水解，阻斷酶解級聯反應，進而對抗胰腺腺泡細胞凋亡，緩解胰腺炎的進展，并可能促進胰腺細胞再生。

綜上所述，川芎嗪可以通過激活EGFR、MAPK1等多種信號通路，減輕ANP后的炎癥反應和氧化應激損傷，增強諸如BCL2L1等抗凋亡基因的表達，阻斷CASP3介導的細胞凋亡半胱天冬酶解級聯反應，對牛磺膽酸鈉誘導的ANP大鼠胰腺組織起保護性作用，為基礎研究和臨床應用提供了新的思路。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明陳杰：研究操作、論文撰寫、數據整理、經費支持；黃石飛：研究操作、論文撰寫、數據整理；韓業紅：研究指導、論文修改、數據整理